HaloTag - HaloTag

Oblast kódující protein HaloTag může být vložena poblíž požadovaného genu. Pro účely čištění je také vložen gen rezistence na ampicilin.

HaloTag je proteinová značka s vlastním označením. Jedná se o peptid o zbytku 297 (33 kDa) odvozený od bakterie enzym, navržený kovalentně se vázat na syntetický ligand. Bakteriální enzym může být fúzován s různými sledovanými proteiny.[1] Syntetický ligand je vybrán z řady dostupných ligandů podle typu experimentů, které mají být provedeny. Tento bakteriální enzym je a haloalkan dehalogenáza, který funguje jako hydroláza a je navržen pro usnadnění vizualizace subcelulární lokalizace sledovaného proteinu, imobilizace sledovaného proteinu nebo zachycení vazebných partnerů sledovaného proteinu v jeho biochemickém prostředí.[2] HaloTag se skládá ze dvou kovalentně vázaných segmentů, včetně haloalkan dehalogenázy a syntetické látky ligand volby. Tyto syntetické ligandy sestávají z reaktivního chloralkanového linkeru navázaného na funkční skupinu.[3] Funkční skupiny mohou být buď biotin (může být použit jako afinitní značka), nebo mohou být vybrány z pěti dostupných fluorescenčních barviv včetně Coumarin, Oregon Green, Alexa Fluor 488, diAcFAM a TMR. Tato fluorescenční barviva lze použít k vizualizaci živých nebo chemicky fixovaných buněk.[4]

Mechanismus

Pět dostupných fluorescenčních barviv, která mohou být navázána na reaktivní linker. Kromě toho lze vizualizovat koncový chlor reaktivního chloralkanu.

HaloTag je hydroláza, která má geneticky modifikované aktivní místo, které se specificky váže na reaktivní chloroalkanový linker a má zvýšenou rychlost vazby ligandu.[5] Reakce, která tvoří vazbu mezi proteinovou značkou a chloroalkanovým linkerem, je rychlá a v podstatě nevratná za fyziologických podmínek díky terminálnímu chloru linkerové části.[6] Ve výše uvedené reakci způsobuje nukleofilní útok chloralkanem reaktivního linkeru vytěsnění halogenu zbytkem aminokyseliny, což vede k tvorbě kovalentního meziproduktu alkyl-enzym. Tento meziprodukt by pak byl hydrolyzován zbytkem aminokyseliny v hydrolase divokého typu.[7] To by vedlo k regeneraci enzymu po reakci. V modifikované haloalkandehalogenáze (HaloTag) však reakční meziprodukt nemůže pokračovat následnou reakcí, protože jej nelze hydrolyzovat kvůli mutaci v enzymu. To způsobí, že meziprodukt přetrvává jako stabilní kovalentní adukt, s nímž není spojena zpětná reakce.[8]

Použití

Různé části fúzního proteinu. Jak je znázorněno na obrázku, protein HaloTag se skládá ze syntetického ligandu a reaktivních částí chloroalkanového linkeru. Protein HaloTag je navázán na požadovaný protein.

HaloTagged fúzní proteiny lze vyjádřit pomocí standardu rekombinantní protein výrazové techniky.[9] Kromě toho existuje několik komerčních vektory dostupné, které vyžadují pouze vložení požadovaného genu. [10] Protože bakteriální dehalogenázy jsou relativně malé a výše popsané reakce jsou pro buňky savců cizí, nedochází k interferenci s endogenními metabolickými reakcemi savců.[11] Jakmile je fúzní protein exprimován, existuje široká škála potenciálních oblastí experimentování, včetně enzymatických testů, buněčného zobrazování, proteinových polí, stanovení subcelulární lokalizace a mnoha dalších možností.[12]

Viz také


Reference

  1. ^ Los GV, Encell LP, McDougall MG, Hartzell DD, Karassina N, Zimprich C a kol. (Červen 2008). „HaloTag: nová technologie značení proteinů pro zobrazování buněk a analýzu proteinů“. ACS Chemická biologie. 3 (6): 373–82. doi:10.1021 / cb800025k. PMID  18533659.
  2. ^ Giepmans BN, Adams SR, Ellisman MH, Tsien RY (duben 2006). „Fluorescenční sada nástrojů pro hodnocení polohy a funkce proteinu“. Věda. 312 (5771): 217–24. Bibcode:2006Sci ... 312..217G. doi:10.1126 / science.1124618. PMID  16614209.
  3. ^ Kogure T, Karasawa S, Araki T, Saito K, Kinjo M, Miyawaki A (květen 2006). „Fluorescenční varianta proteinu z kamenitých korálů Montipora umožňuje dvoubarevnou jednolaserovou fluorescenční křížovou korelační spektroskopii“. Přírodní biotechnologie. 24 (5): 577–81. doi:10.1038 / nbt1207. PMID  16648840.
  4. ^ Miller LW, Cornish VW (únor 2005). "Selektivní chemické značení proteinů v živých buňkách". Aktuální názor na chemickou biologii. 9 (1): 56–61. doi:10.1016 / j.cbpa.2004.12.007. PMID  15701454.
  5. ^ Pries F, Kingma J, Krooshof GH, Jeronimus-Stratingh CM, Bruins AP, Janssen DB (květen 1995). „Histidin 289 je nezbytný pro hydrolýzu alkyl-enzymového meziproduktu haloalkandehalogenázy“. The Journal of Biological Chemistry. 270 (18): 10405–11. doi:10.1074 / jbc.270.18.10405. PMID  7737973.
  6. ^ Waugh DS (červen 2005). "Maximální využití afinitních značek". Trendy v biotechnologii. 23 (6): 316–20. doi:10.1016 / j.tibtech.2005.03.012. PMID  15922084.
  7. ^ Chen I, Ting AY (únor 2005). "Specifické značení proteinů malými molekulami v živých buňkách". Aktuální názor na biotechnologie. 16 (1): 35–40. doi:10.1016 / j.copbio.2004.12.003. PMID  15722013.
  8. ^ Marks KM, GP Nolan (srpen 2006). "Strategie chemického značení pro buněčnou biologii". Přírodní metody. 3 (8): 591–6. doi:10.1038 / nmeth906. PMID  16862131.
  9. ^ Adams SR, Campbell RE, Gross LA, Martin BR, Walkup GK, Yao Y a kol. (Květen 2002). "Nové biarsenické ligandy a tetracysteinové motivy pro značení proteinů in vitro a in vivo: syntéza a biologické aplikace". Journal of the American Chemical Society. 124 (21): 6063–76. doi:10.1021 / ja017687n. PMID  12022841.
  10. ^ „Vektory HaloTag na Promega“. Citováno 9. února 2017.
  11. ^ Naested H, Fennema M, Hao L, Andersen M, Janssen DB, Mundy J (červen 1999). „Bakteriální gen haloalkan dehalogenázy jako negativní selektovatelný marker u Arabidopsis“ (PDF). The Plant Journal. 18 (5): 571–6. doi:10.1046 / j.1365-313x.1999.00477.x. PMID  10417708.
  12. ^ Janssen DB (duben 2004). "Vyvíjející se haloalkan dehalogenázy". Aktuální názor na chemickou biologii. 8 (2): 150–9. doi:10.1016 / j.cbpa.2004.02.012. PMID  15062775.