Elektroforéza s volným tokem - Free-flow electrophoresis

Elektroforéza s volným tokem (FFE), také známý jako elektroforéza bez nosiče, je bez matice elektroforetický separační technika. FFE je analogická technika kapilární elektroforéza, se srovnatelným rozlišením, které lze použít pro vědecké otázky, kde jsou zapotřebí semipreparativní a preparativní množství vzorků. Používá se ke kvantitativnímu oddělení vzorků podle rozdílů v náboji nebo izoelektrickém bodě. Vzhledem k univerzálnosti této techniky je k dispozici široká škála protokolů pro oddělování vzorků vzácný kov ionty, protein izoformy, multiproteinové komplexy, peptidy, organely, buňky, DNA origami, krevní sérum a nanočástice existovat. Výhodou FFE je rychlá a šetrná separace vzorků rozpuštěných v kapalném rozpouštědle bez nutnosti použití matrice polyakrylamid v Gelová elektroforéza. Tím je zajištěna velmi vysoká míra výtěžnosti, protože analyt nedrží žádnou nosnou nebo maticovou strukturu. Vzhledem ke své kontinuální povaze a vysoké objemové propustnosti umožňuje tato technika rychlé oddělení preparativního množství vzorků s velmi vysokým rozlišením. Dále lze separace provádět za nativních nebo denaturačních podmínek.[1]

Dějiny

FFE vyvinul v 60. letech Kurt Hannig z Max-Planckova institutu v Německu.[2] Do osmdesátých let to byla standardizovaná technologie pro oddělení buňky a organely a FFE byl dokonce testován ve vesmíru, aby se minimalizovalo sedimentace pod nulou gravitace.[3] Tak jako průtoková cytometrie se stala standardní metodou pro třídění buněk, vývoj FFE se zaměřil na separaci proteinů a nabitých částic. Některé skupiny také pracují na miniaturizovaných verzích systémů FFE nebo micro FFE.[4]

Technika

Oddělovací komora se skládá z zadní desky a přední desky. Zadní deska se obvykle skládá z chlazeného hliníkového bloku pokrytého plastovým skleněným zrcadlem. Přední deska je dnes vyrobena z PMMA, v dřívějších dobách bylo použito sklo. Vzdálenost mezi přední a zadní deskou lze upravit pomocí rozpěr a je obvykle mezi 0,1 - 0,5 mm. Přední deska také obsahuje vstupy pro separační pufry a vzorek, výstupy pro frakcionační zkumavky a platinové dráty jako elektrody. Aplikováním různých pufrů na více vstupů pufru je operátor schopen měnit pH, koncentrace solí nebo složení a tedy podmínky separace po celé šířce komory. Separační pufry a vzorek jsou aplikovány pomocí peristaltická čerpadla, zajistit laminární proudění. Vysoké napětí elektrické pole se aplikuje kolmo na laminární proudění. Analyty v laminárním toku lze oddělit pomocí hustota náboje a / nebo izoelektrický bod. Vzhledem ke své vysoce univerzální povaze může tato technika využívat různé způsoby elektroforézy, jako je například izotachoforéza, izoelektrická fokusace nebo (intervalová) zónová elektroforéza.

Na konci separační cely se separovaný vzorek rozdělí na frakcionační zkumavky a shromáždí na mikrotitrační destičky.[5]

Schematická funkčnost elektroforézy s volným tokem

Poté mohou být vzorky charakterizovány všemi hlavními technikami, jako je HPLC, LC-MS, hmotnostní spektrometrie (ESI / MALDI, v závislosti na použitém protokolu) nebo elektroforéza (IEF / STRÁNKA SDS, 2D STRÁNKA ).

Aplikace

Standardní aplikace zahrnují separaci proteinových komplexů, membránových proteinů, izoforem proteinů a protilátek, buněk, subcelulárních kompartmentů (jako jsou organely, ribozomy) a liposomů s vysokým rozlišením.[6] Využitím velmi plochých gradientů pH generovaných amfolyty je možné oddělit proteinové izoformy, které se mění o méně než 0,02 jednotky pH, s výkonem kolem 3 mg / h.[7]Je také možné přidat do pufrů přísady, aby se zvýšilo rozlišení nebo denaturovaly vzorky. Typické koncentrace močoviny do 8 M, 0,1 - 1% detergentů, jako jsou: CHAPS, CHAPSO, Digitonin, Dodecyl-ß-D-maltosid, Octyl-ß-D-glukosid, Triton-X-114 (IEF) a DTT až 50 mM je tolerováno.

Klíčové vlastnosti

  • Bez matriční separace, ideální pro zachování proteinové aktivity / proteinových komplexů
  • Separace proteinových komplexů, membránových proteinů, proteinových izoforem, buněk, subcelulárních kompartmentů (jako organel, ribozomů atd.) S vysokým rozlišením,
  • Rozsah velikosti separace od iontů po úplné buňky
  • Obnova vzorku až 99%, v závislosti na vzorku a režimu provozu
  • Vysoká reprodukovatelnost jednotlivých běhů
  • Oddělení za několik minut
  • Protokoly pro izoelektrickou fokusační separaci s různými komerčními amfolyty a atoxickým malomolekulárním ProLytesTM pro přímou klinickou aplikaci
  • Rychlá a citlivá detekce kvality separace pomocí UV, IEF gelů
  • Kompatibilní s mnoha dalšími navazujícími technikami, např. HPLC, MS, SDS-, IEF- a 2D-GE
  • Vhodný pro separaci nestabilních proteinů díky ochlazení vzorků a separační komoře na 4 ° C
  • Snížení složitosti proteomu před další proteomickou analýzou [8]
  • Obohacení bílkovin s nízkým výskytem odstraněním přebytku nežádoucích bílkovin
  • Kompatibilní s velkým i malým objemem vzorku od přibližně 50 µL do několika mililitrů.
  • Přípravné i analytické provozní režimy
  • Podporuje všechny režimy elektroforetické separace (IEF, IZE, ZE, ITP)
  • Lze spustit za nativních nebo denaturačních podmínek


Reference

  1. ^ P.D. Patel a G. Weber, Electroforesis in free fluid: a review of the technology and agropood applications, J. Biol. Phys. Chem. 2003, 3, 60–73.
  2. ^ Elektroforéza s volným tokem, Kurt Hannig und Hans G. Heidrich, GIT Verlag 1990, ISBN  3-921956-88-9
  3. ^ Elektroforéza ve vesmíru - 1985, PDF
  4. ^ S. Jezierski, L. Gitlin, S. Nagl, D. Belder, multistepová litografie v kapalné fázi pro rychlé prototypování mikrofluidních čipů pro volnou průtokovou elektroforézu, Anal. Bioanal. Chem., 2011, 401, 2651-2656.
  5. ^ „Princip separace FFE“. Archivovány od originál dne 01.12.2014. Citováno 2013-06-04.
  6. ^ Aplikace elektroforézy s volným tokem
  7. ^ [1]
  8. ^ Islinger, M; Eckerskorn, C; Völkl, A (2010). „Elektroforéza s volným tokem v proteomické éře: technika toku“. Elektroforéza. 31: 1754–63. doi:10.1002 / elps.200900771. PMID  20506416.

externí odkazy