Ztráta fluorescence ve fotobělení - Fluorescence loss in photobleaching - Wikipedia

Snížená fluorescence v definované oblasti (červené pole) přiléhající k vybělené oblasti (kruh)

Ztráta fluorescence ve fotobělení (FLIP) je fluorescenční mikroskopie technika používaná ke zkoumání pohybu molekul uvnitř buněk a membrán. Buněčná membrána je typicky označena fluorescenčním barvivem, aby bylo možné pozorování. Specifická oblast této označené části je poté několikrát vybělena paprskem a konfokální laserový skenovací mikroskop. Po každém imaginárním skenování dojde opět k bělení. K tomu dochází několikrát, aby bylo zajištěno, že jsou všechny přístupné fluorofory jsou bělené, protože nebělené fluorofory jsou vyměňovány za bělené fluorofory, což způsobuje pohyb buněčnou membránou. Poté se po určitou dobu měří množství fluorescence z této oblasti, aby se určily výsledky fotobělení na buňce jako celku.

Experimentální nastavení

Předtím, než může dojít k fotobělení, musí být buňkám injikován fluorescenční protein, často a zelený fluorescenční protein (GFP), což umožní cílovým proteinům fluoreskovat, a proto je třeba je sledovat v průběhu celého procesu. Poté musí být definována oblast zájmu. Tato počáteční oblast zájmu obvykle obsahuje celou buňku nebo několik buněk. Ve FLIP dochází k fotobělení těsně mimo oblast zájmu; proto je také třeba definovat oblast bělení fotobuněk. Je také třeba určit třetí region, region, kde bude měření probíhat. Před fotobělením je třeba provést řadu počátečních skenů pro stanovení fluorescence. Tyto skeny budou sloužit jako kontrolní skeny, s nimiž budou později vybledlé skeny porovnány. Poté může dojít k fotobělení. Mezi každým bělícím pulzem je nutné ponechat čas na zotavení fluorescenčního materiálu. Je také důležité provést několik skenů oblasti zájmu bezprostředně po každém bělícím pulzu pro další studium.[1] Změnu fluorescence v oblasti zájmu lze poté kvantifikovat jedním ze tří způsobů. Nejběžnější je zvolit umístění, velikost a počet oblastí zájmu na základě vizuální kontroly sad obrázků. Dva další, poměrně nové, ale spolehlivější přístupy jsou buď detekcí oblastí různé pohyblivosti sondy na základě individuálního obrazu, nebo fyzickým modelováním ztráty fluorescence z pohybujících se těl.[2]

Ztráta fluorescence je definována mobilní frakcí nebo frakcí fluoroforů schopných se zotavit do fotobělené oblasti fluorescenčně značeného proteinu. Neúplná ztráta fluorescence naznačuje, že existují fluorofory, které se nepohybují ani necestují do vybělené oblasti. To umožňuje definici imobilní frakce nebo frakce fluoroforů, které nejsou schopny se zotavit do fotobělené oblasti, fluorescenčně značených proteinů. Nehybnost naznačuje, že existují proteiny, které mohou být v kompartmentech uzavřených od zbytku buňky, což jim brání v ovlivnění opakovaným odbarvováním.[3]

Aplikace

Ověření kontinuity membránových organel

Primárním použitím FLIP je stanovení kontinuity membránových organel. Tato kontinuita nebo její nedostatek je určena pozorováním množství fluorescence v oblasti zájmu. Pokud dojde k úplné ztrátě fluorescence, znamená to, že organely jsou spojité. Pokud však nedojde k úplné ztrátě fluorescence, pak mezi organelami není kontinuita. Místo toho jsou tyto organely rozděleny do segmentů, a proto jsou uzavřeny pro přenos jakýchkoli fotobělených fluoroforů.[3] Kontinuita Golgiho aparátu, endoplazmatického retikula a jádra byla ověřena pomocí FLIP.

Směnný kurz mezi jádrem a cytoplazmou

Dvě další, méně často používaná použití FLIP, jsou určit, jak jsou proteiny dopravovány z cytoplazmy do jádra, a poté určit rychlost, s jakou k tomuto převodu dochází. K určení, které části jsou zahrnuty a kdy jsou zahrnuty v procesu přepravy, jsou sledovány nepřetržité skenování. Čím dříve se část cytoplazmy použije v procesu převodu, tím rychleji dojde k úplné ztrátě fluorescence.[4] Výsledným obrazem tohoto procesu by měla být zcela fotobělená cytoplazma. Pokud se buňka také podílí na exportu jádra z jádra do cytoplazmy, dojde v jádře také k bělení fotek.

Z tohoto typu dat lze také určit směnný kurz mezi jádrem a cytoplazmou. V těchto případech je oblast fotobělení v jádru. Dojde-li k překročení rychlosti rychlým tempem, úroveň fluorescence v jaderných oddílech se rychle sníží skrz pořízené snímky. Pokud však dojde k zpomalení pomalu, úrovně fluorescence zůstanou nedotčeny nebo se sníží jen mírně.[4]

FLIP vs. FRAP

FLIP se často používá a je s ním úzce spojen Obnova fluorescence po fotobělení (FRAP). Hlavní rozdíl mezi těmito dvěma mikroskopickými technikami spočívá v tom, že FRAP zahrnuje studium schopnosti buňky zotavit se po jedné události odbarvení, zatímco FLIP zahrnuje studium toho, jak se ztráta fluorescence šíří po celé buňce po několika událostech odbarvení. Tento rozdíl v účelu také vede k rozdílu v tom, jaké části buňky jsou pozorovány. Ve FRAP je oblast, která je ve skutečnosti fotobělená, oblastí zájmu. Naopak ve FLIP je oblast zájmu těsně mimo oblast, která je fotobělena. Dalším důležitým rozdílem je, že ve FRAP existuje jediná událost odbarvení a doba zotavení, při které se sleduje, jak dobře se fluorofory přesouvají zpět na bělené místo. Ve FLIPu však dochází k několika událostem bělení, aby se zabránilo návratu nebělených fluoroforů do bělící oblasti. Stejně jako FLIP se FRAP používá při studiu kontinuity membránových organel. FLIP a FRAP se často používají společně k určení mobility proteinů označených GFP.[3] FLIP lze také použít k měření molekulárního přenosu mezi oblastmi buňky bez ohledu na rychlost pohybu. To umožňuje komplexnější analýzu přenosu proteinů v buňce. To se liší od FRAP, který je primárně užitečný pro stanovení mobility proteinů v regionech pouze pro místní bělení.[5]

Potenciální komplikace

Existuje několik komplikací, které jsou spojeny s FLIP i FRAP. Jelikož obě formy mikroskopie zkoumají živé buňky, vždy existuje možnost, že se buňky pohnou, což způsobí falešné výsledky. Nejlepším způsobem, jak tomu zabránit, je použít algoritmus zarovnání, který bude kompenzovat jakýkoli pohyb a eliminovat velkou část chyby v důsledku pohybu. V těchto experimentech je také klíčové mít kontrolní skupinu, aby bylo možné upravit výsledky a opravit křivku zotavení pro celkovou ztrátu fluorescence.[3] Dalším způsobem, jak minimalizovat chyby, je udržovat fotobělení obsažené v jedné oblasti nebo oblasti. Toto omezení bude sloužit jako kontrola a omezit ztrátu fluorescence v důsledku foto-poškození ve srovnání se ztrátou fluorescence v důsledku bělení fotografií.[3]

Viz také

Reference

  1. ^ Robert C. Dickson; Michael Dean Mendenhall (2004). Protokoly přenosu signálu (2. vyd.). Springer Science & Business Media. 300–304. ISBN  978-1-59259-816-8.
  2. ^ Wüstner, Daniel; Lukasz M Solanko; Frederik W Lund; Daniel Sage; Hans J Schroll; Michael A Lomholt (13. listopadu 2012). „Kvantitativní ztráta fluorescence ve fotobělení pro analýzu transportu a agregace proteinů“ (PDF). BMC bioinformatika. 13: 296. doi:10.1186/1471-2105-13-296. PMC  3557157. PMID  23148417. Citováno 25. listopadu 2012.
  3. ^ A b C d E Ishikawa-Ankerhold, Hellen C .; Ankerhold, Richard; Bubeník, Gregor P. C. (2012). „Pokročilé techniky fluorescenční mikroskopie - FRAP, FLIP, FLAP, FRET a FLIM“. Molekuly. 17 (4): 4047–4132. doi:10,3390 / molekuly17044047. PMC  6268795. PMID  22469598.
  4. ^ A b Davies, R.G .; D.A. Jans; K.M. Wagstaff (2010). „Použití technik fluorescenčního fotobělení k měření kinetiky intracelulárního transportu“ (PDF). Mikroskopie: věda, technologie, aplikace a vzdělávání. Archivovány od originál (PDF) dne 2014-12-26. Citováno 2012-11-25.
  5. ^ Kitamura, Akira; Kubota, Hiroshi (prosinec 2010). "Amyloidní oligomery: dynamika a toxicita v cytosolu a jádru". FEBS Journal. 277 (6): 1369–1379. doi:10.1111 / j.1742-4658.2010.07570.x. PMID  20148962.