Značka aktivující fluorescenci a posunující absorpci - Fluorescence-activating and absorption-shifting tag - Wikipedia

RYCHLE (Značka aktivující fluorescenci a posunující absorpci) je malý, geneticky kódovaný, proteinová značka což umožňuje fluorescenční hlášení sledovaných proteinů. Na rozdíl od přírodních fluorescenčních proteinů a derivátů, jako je GFP nebo mCherry, FAST sám o sobě fluorescentní není. Může se selektivně vázat na fluorogenní chromofor odvozený od 4-hydroxybenzyliden rhodaninu (HBR), který sám o sobě není fluorescenční, pokud není vázán. Po navázání prochází pár molekul jedinečným mechanismem aktivace fluorogenu založeným na dvou spektroskopických změnách, zvýšení kvantového výtěžku fluorescence a posunu absorpční červeně, čímž poskytuje vysokou selektivitu značení. Systém hlášení FAST-fluorogen lze použít ve fluorescenční mikroskopii, průtokové cytometrii a jakékoli jiné fluorometrické metodě k prozkoumání živého světa: biosenzory, obchodování s proteiny.

FAST, malý 14 kDa protein, byl vyroben z fotoaktivního žlutého proteinu (PYP) řízenou evolucí. Poprvé to v roce 2016 oznámili vědci z Ecole normale supérieure de Paris.[1]

Mechanismus

FAST se týká chemicko-genetické strategie pro specifické značení proteinů. Peptidová doména, nazývaná „značka“, je geneticky kódována tak, aby byla navázána na požadovaný protein (kombinací příslušných genů pomocí transfekce nebo infekce). Tato značka je kotvou pro další přidání syntetické fluorescenční sondy.[2] Takový chemicko-genetický přístup byl již implementován kromě přírodních fluorescenčních proteinů, jako jsou GFP nebo jejich deriváty jako např mCherry v několika již široce používaných systémech:

  • od roku 2003, Značka SNAP, dvousložkový systém hlášení sestávající z peptidu 19 kDa odvozeného z lidského enzymu, Ó6-methylguanin-ADN methyltransferáza, která se vyvinula za vzniku kovalentních vazeb s fluorescencí Ó6-benzylguaninové deriváty; Značka SNAP se později vyvinula v značku ortogonální, Značka CLIP;
  • od roku 2008, HaloTag, dvousložkový systém hlášení sestávající z peptidu 33 kDa odvozeného od bakteriálního enzymu, haloalkan deshalogenázy, který může specificky vázat funkční halogenované syntetické ligandy, nejčastěji fluorescenční pro zobrazování buněk (např.„Coumarine, Oregon Green, Alexa Fluor 488, diAcFAM, TMR).
Reverzibilní vazba mezi FAST a fluorogenem

Bylo popsáno několik verzí FAST, které se liší malým počtem mutací, např., FAST1 (také znám jako Y-FAST), FAST2 (také znám jako iFAST) nebo dimer, td-FAST.[3] Byla také vyvinuta verze doplňkové split pro monitorování interakcí protein-protein, splitFAST.[4] V Addgene je k dispozici řada plazmidů zobrazujících geny FAST nebo splitFAST.[5]

Aplikace

V systému se používá systém hlášení FAST-fluorogen fluorescenční mikroskopie, průtoková cytometrie a jakékoli další fluorometrické metody zkoumání živého světa, včetně biosenzory a obchodování s bílkovinami. FAST byl popsán pro dynamické zobrazování biofilmů kvůli své jedinečné kapacitě fluorescence v podmínkách s nízkým obsahem kyslíku.[6] Ze stejného důvodu umožňuje zobrazování a FACSing anaerobů, jako jsou Clostridium, používané k fermentaci biomasy jako Fermentace ABE.[7] RYCHLÉ bylo také hlášeno pro mikroskopie s vysokým rozlišením živých buněk.[8]

Řada fluorogenů byla vyvinuta pro FAST a jeho deriváty společností The Twinkle Factory, která se lišila podle jejich vlnové délky emise, jejich jasu a afinity značek. Některé neprostupují, tj., nemohou projít buněčnými membránami, a proto specificky označují membránové proteiny nebo extracelulární proteiny, což umožňuje, např., sledování obchodování od syntézy až po vylučování.[9]

Reference

  1. ^ Plamont, Marie-Aude; Billon-Denis, Emmanuelle; Maurin, Sylvie; Gauron, Carole; Pimenta, Frederico M .; Specht, Christian G .; Shi, Jian; Quérard, Jérôme; Pan, Buyan; Rossignol, Julien; Moncoq, Karine (2015-12-28). „Malá značka aktivující fluorescenci a posunující absorpci pro laditelné zobrazování proteinů in vivo“. Sborník Národní akademie věd. 113 (3): 497–502. doi:10.1073 / pnas.1513094113. ISSN  0027-8424. PMC  4725535. PMID  26711992.
  2. ^ Plamont, Marie-Aude; Billon-Denis, Emmanuelle; Maurin, Sylvie; Gauron, Carole; Pimenta, Frederico M .; Specht, Christian G .; Shi, Jian; Quérard, Jérôme; Pan, Buyan; Rossignol, Julien; Moncoq, Karine (2016-01-19). „Malá značka aktivující fluorescenci a posunující absorpci pro laditelné zobrazování proteinů in vivo“. Sborník Národní akademie věd. 113 (3): 497–502. Bibcode:2016PNAS..113..497P. doi:10.1073 / pnas.1513094113. ISSN  0027-8424. PMC  4725535. PMID  26711992.
  3. ^ Tebo, Alison G .; Pimenta, Frederico M .; Zhang, Yu; Gautier, Arnaud (02.10.2018). „Vylepšené chemicko-genetické fluorescenční značky pro mikroskopii živých buněk“ (PDF). Biochemie. 57 (39): 5648–5653. doi:10.1021 / acs.biochem.8b00649. ISSN  0006-2960. PMID  30204425.
  4. ^ Tebo, Alison G .; Gautier, Arnaud (2019-08-14). „Oprava autora: Rozdělený fluorescenční reportér s rychlou a reverzibilní komplementací“. Příroda komunikace. 10 (1): 3730. Bibcode:2019NatCo..10.3730T. doi:10.1038 / s41467-019-11689-6. ISSN  2041-1723. PMC  6694131. PMID  31413330.
  5. ^ „Addgene: Arnaud Gautier Lab Plasmids“. www.addgene.org. Citováno 2019-11-25.
  6. ^ Monmeyran, Amaury; Thomen, Philippe; Jonquière, Hugo; Sureau, Franck; Li, Chenge; Plamont, Marie-Aude; Douarche, Carine; Casella, Jean-François; Gautier, Arnaud; Henry, Nelly (07.07.2018). „Indukovatelný chemicko-genetický fluorescenční marker FAST překonává klasické fluorescenční proteiny v kvantitativním hlášení dynamiky bakteriálního biofilmu“. Vědecké zprávy. 8 (1): 10336. Bibcode:2018NatSR ... 810336M. doi:10.1038 / s41598-018-28643-z. ISSN  2045-2322. PMC  6037777. PMID  29985417.
  7. ^ Charubin, Kamil; Bennett, R. Kyle; Rychle, Alan G .; Papoutsakis, Eleftherios T. (listopad 2018). „Inženýrství organismů Clostridium jako mikrobiálních buněčných továren: výzvy a příležitosti“. Metabolické inženýrství. 50: 173–191. doi:10.1016 / j.ymben.2018.07.012. ISSN  1096-7176. PMID  30055325.
  8. ^ Venkatachalapathy, Muthukumaran; Belapurkar, Vivek; Jose, Mini; Gautier, Arnaud; Nair, Deepak (2019). "Zobrazování super rozlišení živých buněk radiálními fluktuacemi pomocí tagů vázajících fluorogen". Nanoměřítko. 11 (8): 3626–3632. doi:10.1039 / c8nr07809b. ISSN  2040-3364. PMID  30734810.
  9. ^ Li, Chenge; Mourton, Aurélien; Plamont, Marie-Aude; Rodrigues, Vanessa; Aujard, Isabelle; Volovitch, Michel; Le Saux, Thomas; Perez, Franck; Vriz, Sophie; Jullien, Ludovic; Joliot, Alain (2018-06-20). „Fluorogenní sondování obchodu s membránovými proteiny“ (PDF). Chemie biokonjugátu. 29 (6): 1823–1828. doi:10.1021 / acs.bioconjchem.8b00180. ISSN  1043-1802. PMID  29791141.