Depyrogenace - Depyrogenation - Wikipedia

Depyrogenace "Odstraňování pyrogenů" se týká odstranění pyrogenů z roztoku, nejčastěji z injekčních farmaceutik.

A pyrogen je definována jako jakákoli látka, která může způsobit horečku. Bakteriální pyrogeny zahrnují endotoxiny a exotoxiny, ačkoli mnoho pyrogenů je pro hostitele endogenních. Mezi endotoxiny patří lipopolysacharid (LPS) molekuly nalezené jako součást buněčné stěny Gramnegativní bakterie a jsou uvolňovány na bakteriální buňku lýza. Endotoxiny se mohou stát pyrogenními, pokud se uvolní do krevního řečiště nebo jiné tkáně, kde se obvykle nenacházejí. Ačkoli tlusté střevo obsahuje hojně gramnegativní bakterie, nezpůsobuje pyrogenní účinek, protože bakterie nepodléhají hrubé lýze a imunitní systém není vystaven volnému endotoxinu, zatímco je stěna tlustého střeva neporušená.

Když se LPS uvolní při lýze bakteriálních buněk, lipidová složka A je nejprve vázána sérovým LPS-vazebným proteinem (LBP) a poté přenesena na CD14 (buď volný CD14 v séru nebo vázán na buněčný povrch makrofágů nebo monocytů). Toto monomerizuje agregovaný LPS, protože LPS receptor Toll-like Receptor 4 (TLR4) nedokáže rozpoznat LPS, když je agregovaný. Monomerní LPS se poté převede na MD-2 prekomplexovaný se zapnutým TLR4 makrofágy a monocyty. To vede k uvolňování prozánětlivých cytokinů a oxidu dusnatého, což může nakonec vést k septickému šoku v závislosti na síle odpovědi. Cévní endoteliální buňky také exprimují TLR4 a MD-2, a tak reagují na LPS přímo, stejně jako prostřednictvím cytokinů a oxidu dusnatého. Bronchiální epiteliální buňky a epitelové buňky tlustého střeva také exprimují TLR4, ale protože neexprimují MD-2, spoléhají se na signál LPS prekomplexovaný sérovým MD-2.

Maximální přijatelná hladina endotoxinu

Protože se molekulová hmotnost endotoxinu může značně lišit (10 000 až 1 000 000 Da), hladiny endotoxinu se měří v „jednotkách endotoxinu“ (EU). Jedna EU je přibližně ekvivalentní 100 pg lipopolysacharidu E. coli - množství přítomné kolem 105 bakterie. U lidí se mohou objevit příznaky, jsou-li vystaveni pouze 5 EU / kg tělesné hmotnosti. Mezi tyto příznaky patří mimo jiné horečka, nízký krevní tlak, zvýšená srdeční frekvence a nízký výdej moči; a dokonce i malé dávky endotoxinu v krevním oběhu jsou často fatální.

Spojené státy Úřad pro kontrolu potravin a léčiv stanovil následující maximální přípustné hladiny endotoxinu pro léky distribuované ve Spojených státech:

  • Droga (injekční, intratekální ) - 0,2 EU / kg tělesné hmotnosti
  • Droga (injekční, neintratekální) - 5 EU / kg tělesné hmotnosti
  • Sterilní voda - 0,25-0,5 EU / ml (v závislosti na zamýšleném použití)

Detekce pyrogenu

Králičí test

Včasná detekce endotoxinu byla dosažena injekcí králíků se vzorkem a pozorováním reakce v jejich tělesné teplotě. Králíci mají podobnou toleranci vůči endotoxinům jako lidé, a proto byli ideální volbou. Tato metoda však byla nákladná, časově náročná a vedla k protestům obhájců práv zvířat. Ale asi největší nevýhodou tohoto testu byla jeho neschopnost kvantifikovat hladinu endotoxinu.

Test LAL

Hlavní článek: Limulus Amebocyte Lysate

V současnosti je běžnou metodou detekce endotoxinů metoda Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test. Tento test je založen na pozorování doktora Frederika Banga, že krevní podkovy tvoří krevní sraženiny, když jsou vystaveny endotoxinům.[1] Extrakt amébocytů z krve kraba podkovy se smísí se vzorkem podezřelým z kontaminace endotoxiny a reakce je pozorována, pokud jsou přítomny endotoxiny. FDA schválil čtyři varianty testu LAL: gelovou sraženinu, turbidimetrický, kolorimetrický a chromogenní test. Rozdíly v těchto variacích se vztahují k charakteristikám reakce amoebocytů / endtoxinů (např. Gelová sraženina vytváří sraženinu a kolorimetrické změny barvy). Tento test je rychlý (přibližně 30 minut) a vysoce citlivý (citlivost až 0,001 EU / ml). Protože však detekuje pouze LPS endotoxiny, některé pyrogenní materiály mohou chybět. Určité podmínky (neoptimální podmínky pH nebo nevhodné) kation koncentrace) může vést k falešným negativům. Glukany z matric sacharidové chromatografie může také vést k falešným pozitivům.[2]

Od roku 2003 je komerčně dostupná syntetická náhrada za test LAL. Tento test rekombinantního faktoru C (rFC) je založen na Limulus koagulační faktor C., část LAL citlivá na LPS. Přijetí tohoto testu bylo pomalé, což se začalo měnit v roce 2016, kdy Evropský lékopis uvedl tento test jako přijatý test bakteriálních toxinů.[3]

Test aktivace monocytů

The Test aktivace monocytů (MAT) používá monocyty v lidské krvi in vitro detekovat pyrogeny. To bylo přidáno do Evropského lékopisu v roce 2010 a přijato FDA v roce 2012.[4]

Odstranění pyrogenu (depyrogenace)

Pyrogeny lze z roztoku často obtížně odstranit kvůli vysoké variabilitě jejich molekulové hmotnosti. Pyrogeny jsou také relativně tepelně stabilní a necitlivé na změny pH. Existuje však několik technik odstraňování.[5]

Iontoměničová chromatografie
Endotoxiny jsou negativně nabité a budou se vázat na anexový výměník. Není-li cílová látka také záporně nabitá, projde kolonou před endotoxinem a lze dosáhnout účinné separace. Tato metoda se někdy používá při čištění albuminy (podrobnosti následují). Ligandy známou afinitu k endotoxinům lze spojit s anexovým systémem, aby se zvýšila jeho vazebná síla k endotoxinu a dále se zlepšila čistota konečného produktu. Mezi typické příklady ligandů vázajících endotoxin patří histamin, heterocyklické sloučeniny obsahující dusík a polymyxin B. Nicméně, polymyxin B Je známo, že indukuje produkci interleukinu-1, exogenního pyrogenu, a proto musí být prokázáno, že v konečném produktu chybí, pokud je použit.
Příklad použití aniontoměničová chromatografie k čištění albuminu:[6]
  • 2% endotoxinu ne vázat na sloupec. Tato 2% se však vymývají před vrcholem albuminu a lze je tedy jednoduše odstranit zahájením sběru poté, co se tato 2% vyplavila.
  • 10% endotoxinu dělá vazba na kolonu (9,8% z původního celkového množství) se nakonec vymyje po vrcholu albuminu. Tomu lze zabránit ve vstupu do konečného produktu zastavením sběru, než k tomu dojde.
  • Zbývajících 90% navázaného endotoxinu (88,2% původního celkového množství) musí být očištěno z kolony pomocí NaOH
Alternativou k výměně aniontů je kationová výměna chromatografie, ve kterém se kladně nabité rozpuštěné látky váží na pevné chromatografické médium. V této metodě se cíl váže na kolonu místo endotoxinu. Endotoxin se poté promyje kolonou a čistý cíl se později vymyje z kolony. Ukázalo se, že kationtoměničová chromatografie účinně čistí β-interferon. (Dembinski a kol.)[7]
Ultrafiltrace
Protože molekulová hmotnost endotoxinů je obvykle vyšší než 10 kD, může být někdy použita ultrafiltrace jako separace na základě velikosti. Vzhledem k vysoké variabilitě velikosti endotoxinů může být obtížné vybrat správnou membránu, proto se tato metoda nejlépe používá pouze v případě, že všechny přítomné endotoxiny jsou větší než 300 000 Da. Ukázalo se, že komerčně dostupné ultra filtry odstraňují pyrogeny na hladinu pod 0,001 EU / ml.[Citace je zapotřebí ]
Destilace
Tato metoda je také založena na velké molekulové hmotnosti a tepelné stabilitě endotoxinů. Nízkomolekulární rozpouštědla lze snadno čistit vařením a shromažďováním kondenzované páry v nádobě bez endotoxinů (viz „zahřívání“ níže). Velké molekuly LPS se snadno neodpařují a zůstávají tak v ohřívací nádobě. Toto je metoda volby pro čištění vody.

Inaktivace / zničení

Protože odstranění pyrogenů je často obtížné, může být někdy výhodnější inaktivace nebo destrukce molekuly LPS.

Kyselinová báze hydrolýza
Ukázalo se, že tato metoda štěpí lipid A z polysacharidu v molekule LPS (viz vpravo). The lipid skupina sama o sobě není rozpustná ve vodě. Nelze se tedy vázat endoteliální buněk, je neaktivní. Avšak acidobazická hydrolýza může denaturovat cílový protein, a je tedy nevhodná při čištění proteinu.
Oxidace
Oxidace pomocí peroxidu vodíku se často používá jako nízkonákladový roztok ničící pyrogen. Mechanismus této destrukce není znám, ale peroxid vodíku může být snadno odstraněn dále po proudu v procesu čištění, a je tedy užitečnou metodou odstranění pyrogenu. Stejně jako acidobazická hydrolýza však není vhodný k čištění proteinů.
Topení
Metody ohřevu se často používají k zajištění toho, aby sklo a další laboratorní vybavení neobsahovalo pyrogenní materiál. Teplo se aplikuje pečením v peci na suché teplo, která je navržena speciálně pro proces depyrogenace. Ačkoli jsou endotoxiny relativně tepelně stabilní, dostatečné zahřátí (250 ° C po dobu 30 minut) vede k a 3-log redukce hladin endotoxinu. Vzhledem k vysokým teplotám není tato metoda také vhodná při čištění proteinů.
Hydroxid sodný
Při čištění proteinů lze hydroxid sodný (NaOH) používat bezpečně a efektivně. Je také široce používán pro depyrogenaci neautoklávovatelných zařízení (např. Plastů) a chromatografických kolon. Ve skutečnosti je při použití anexu k odstranění pyrogenů nutné po každé dávce kolonu vyčistit NaOH.

Preventivní metody

Vzhledem k tomu, že prakticky všechny suroviny zapojené do výrobního procesu, včetně zaměstnanců továrny, mohou být potenciálními zdroji kontaminace pyrogenem, může prosévání surovin a depyrogenace často přispět k zajištění toho, že konečný produkt neobsahuje pyrogeny a nevyžaduje nákladné odstraňování nebo inaktivační metody. Může být užitečná ultrafiltrace chemikálií a pufrových roztoků, použití vhodných hygienických postupů a provádění pravidelných testů.

Viz také

Reference

  1. ^ Greer, Spencer; Health, JH Bloomberg School of Public. "Frederik Bang". Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health.
  2. ^ [Sandle, T. (2013). Nečistoty farmaceutických produktů: S ohledem na beta-glukany, American Pharmaceutical Review, 16 (5) dodatek S1: 16-19]
  3. ^ Maloney, Tom; Phelan, Ryan; Simmons, Naira (12. října 2018). „Záchrana kraba podkovy: Syntetická alternativa k krvi kraba podkovy pro detekci endotoxinu“. PLOS Biology. 16 (10): e2006607. doi:10.1371 / journal.pbio.2006607.
  4. ^ Pokyny pro průmyslové testování na přítomnost pyrogenů a endotoxinů: otázky a odpovědi, FDA, červen 2012
  5. ^ Sandle, Tim (říjen 2011). „Praktický přístup ke studiím depyrogenace pomocí bakteriálního endotoxinu“. Journal of GXP Compliance. 15 (4).
  6. ^ Chromatografické odstranění endotoxinů a / nebo ethanolu z albuminu. Poznámka k aplikaci 206. Pharmacia Biotech., Uppsala, 1990.
  7. ^ Dembinski, W .; O'Malley, J. A.; Sulkowski, E. Postup čištění ve velkém měřítku pro interferon lidského fibroblastu. Vědecká memoranda o interferonu, Jan./Feb., 6 (1983).