CITE-sekv - CITE-Seq

tento článek je sirotek, jako žádné další články odkaz na to. Prosím zavést odkazy na tuto stránku z související články; zkuste Najít odkaz nástroj pro návrhy. (Červen 2019)

CITE-sekv (Cmobilní Jándexing z Transcriptomy a Epitopes od Sekvuencing) je metoda provádění Sekvenování RNA spolu se získáním kvantitativních a kvalitativních informací o povrchových proteinech s dostupnými protilátkami na úrovni jedné buňky. Doposud bylo prokázáno, že metoda pracuje pouze s několika proteiny na buňku. Jako takový poskytuje další vrstvu informací pro stejnou buňku kombinací obou proteomika a transkriptomická data. U fenotypizace se ukázalo, že tato metoda je stejně přesná jako průtoková cytometrie (zlatý standard) skupinami, které jej vyvinuly.^[1] V současné době je to spolu s REAP-Seq jednou z hlavních metod pro hodnocení genové exprese a hladiny proteinů současně u různých druhů.

Metodu stanovil New York Genome Center ve spolupráci s Laboratoř Satija.^[1]

Aplikace

Souběžné měření hladin proteinu i transkriptu otevírá příležitosti k použití CITE-Seq v různých biologických oblastech, kterých se vývojáři dotkli. Například může být použit k charakterizaci heterogenity nádoru u různých druhů rakoviny, což je hlavní oblast výzkumu.^[2] Umožňuje také identifikovat vzácné subpopulace buněk jako vysoce výkonnou jednobuněčnou metodu, a tak detekovat informace jinak ztracené hromadnými metodami.^[2] Může také pomoci při klasifikaci nádorů - například identifikaci nových podtypů.^[2] Všechno výše uvedené je možné díky jednobuněčnému výstupu dat proteinu i transkriptu současně, což také vede k novým informacím o korelaci protein-RNA.

Má také potenciál v imunologii. Lze jej například použít k charakterizaci imunitních buněk - nedávný výzkum T-buněk zkoumal schopnost T buněk udržovat efektorový stav.^[3] Další studie jednoho ze spoluautorů CITE-Seq navrhla CITE-Seq jako metodu k pohledu na mechanismy interakcí hostitel-patogen.^[4]

Pracovní postup

CITE-seq, jako každá jiná technika sekvenování, má mokrou laboratorní část, kde jsou připraveny skutečné protilátky, obarveny buňky, cDNA připraví se syntetizované a RNA knihovny, které se dále sekvenují a získá se suchá laboratorní část pro analýzu sekvenčních dat. Nejdůležitější částí experimentů s mokrými laboratořemi je návrh konjugáty protilátka-oligonukleotid a titrace množství každého konjugátu, které musí být přítomno v poolu, aby se dosáhlo požadovaného odečtu a kvantifikace.

Schéma pracovního postupu mokré laboratoře pro CITE-Seq

Mokrý laboratorní pracovní postup

První krok zahrnuje přípravu konjugátů protilátka-oligo také známých jako Antibody-Dvyšel Tags (ADT). Příprava ADT zahrnuje značení protilátky namířené proti požadovanému proteinu buněčného povrchu oligonukleotidy pro čárové kódování protilátky.

Jakmile máte ADT, dalším krokem je svázat buňky s požadovaným fondem ADT. Knihovny scRNA-seq lze připravit za použití Drop sekv, 10X Genomics nebo ddSeq metody. Stručně řečeno, buňky označené ADT jsou zapouzdřeny do kapičky jako jednotlivé buňky s mikrokuličkami označenými DNA.^[5]

V kapičce jsou buňky dále lyžovány, aby se uvolnily jak vázané ADT, tak i mRNA. Ty se pak převádějí na cDNA. Každá sekvence DNA na mikrokuličce má jedinečný čárový kód, čímž indexuje cDNA s čárovými kódy buněk. cDNA se připravuje jak z ADT, tak z buněčných mRNA.

V dalším kroku, na základě pokynů vývojáře, je cDNA amplifikována pomocí PCR a ADT cDNA a mRNA cDNA jsou odděleny na základě velikosti (obecně jsou cDNA odvozené od ADT <180 bp a cDNA odvozené od mRNA> 300 bp).^[6] Každá z oddělených molekul cDNA je nezávisle amplifikována a purifikována za účelem přípravy sekvenčních knihoven. Nakonec jsou nezávislé knihovny sloučeny dohromady a seřazeny. Data proteomiky a transkriptomiky lze tedy získat z jediného sekvenčního běhu.

Schéma pracovního postupu suché laboratoře pro CITE-Seq

Pracovní postup suché laboratoře

Analýza sekvenování jednotlivých buněk představuje mnoho výzev, například stanovení nejlepšího způsobu normalizace dat.^[7] Kvůli nové úrovni komplikací, které vznikají ze sekvenování jak proteinů, tak transkriptů na úrovni jedné buňky, udržují vývojáři CITE-Seq a jejich spolupracovníci několik nástrojů, které pomáhají s analýzou dat.

analýza dat scRNA-Seq na základě pokynů vývojáře:^[1][8] Kroky počáteční analýzy jsou stejné jako ve standardu scRNA-sekv experiment. Nejprve je třeba, aby byla čtení srovnávána s referenčním genomem druhu, který je předmětem zájmu, a byly odstraněny buňky s velmi nízkým počtem transkriptů mapovaných do reference. Nakonec se získá normalizovaná matice počtu s hodnotami genové exprese.

Analýza dat ADT^{[1][6][9][10]} (na základě pokynů vývojáře): CITE-seq-Count je balíček Pythonu od vývojářů CITE-Seq, který lze použít k získání hrubých počtů. Balíček Seurat od laboratoře Satija dále umožňuje kombinovat počty proteinů a RNA a provádět shlukování na obou měřeních, stejně jako provádět diferenciální analýzu exprese mezi sledovanými buněčnými klastry. Kvantifikace ADT musí brát v úvahu rozdíly mezi protilátkami. Podobně jako u filtru může být pro snížení šumu zapotřebí filtrování scRNA-sekv analýza. Ale na rozdíl od údajů o RNA, kvůli vyššímu množství bílkovin v buňce, dochází k menšímu výpadku.

Analýzy mohou vyústit v identifikaci nových buněčných shluků pomocí takových metod, jako je PCA nebo tSNE, klíčové geny odpovědné za specifickou funkci buněk a další nové poznatky specifické pro konkrétní otázku. Obecně platí, že výsledky získané s počty ADT podstatně zvyšují množství informací získaných prostřednictvím transkriptomik jednotlivých buněk.

Adaptace techniky

Schéma hašování buněk

Aplikace konjugátů protilátka-oligonukleotid se rozšířily za CITE-seq a lze je přizpůsobit pro multiplexování vzorků i pro CRISPR obrazovky.

Hašování buněk: New York Genome Center dále přizpůsobilo použití jejich konjugátů protilátka-oligonukleotid, aby umožnilo multiplexování vzorků pro scRNA-seq. Tato technika zvaná Cell Hashing,^[11] používá protilátky značené oligonukleotidy proti všudypřítomně exprimovaným proteinům buněčného povrchu z konkrétního vzorku tkáně. V tomto případě obsahuje oligonukleotidová sekvence jedinečný čárový kód, který by byl specifický pro buňky z odlišných vzorků. Toto značení buněk specifické pro vzorek umožňuje sdružování sekvenčních knihoven připravených z různých vzorků na sekvenční platformě. Sekvenování značek protilátky spolu s buněčným transkriptomem pomáhá identifikovat vzorek původu pro každou analyzovanou buňku. Unikátní sekvence čárového kódu použitá na protilátce pro hašování buněk může být navržena tak, aby se odlišovala od čárového kódu protilátky přítomného v ADT použitých v CITE-seq. To umožňuje spárovat hašování buněk s CITE-seq v jediném sekvenčním běhu.^[11] Hashování buněk umožňuje super-načítání platformy scRNA-seq, což má za následek nižší náklady na sekvenování. Umožňuje také detekci artefaktových signálů z multipletů, což je hlavní výzva scRNA-seq. Metodu hašování buněk dále použil Gaublomme et al. k multiplexu jednojádrových RNA-seq (snRNA-seq ) provedením hašování jádra.^[12]

ECCITE-seq: Expanded CRISPR kompatibilní Cmobilní Jándexing z Transcriptomy a Epitopes sekvenováním nebo ECCITE-seq byl vyvinut pro použití použití CITE-seq k charakterizaci více modalit z jedné buňky. Úpravou základního protokolu CITE-seq na scRNA-seq test založený na značce 5 'dokáže detekovat transkriptom, klonotypy imunitního receptoru, povrchové markery, identitu vzorku a jednotlivé vodicí RNA (sgRNA) z každé jednotlivé buňky.^[13] Schopnost ECCITE-seq detekovat molekuly sgRNA a měřit jejich účinek na hladiny genové exprese otevírá perspektivu uplatnění této techniky na obrazovkách CRISPR.

Výhody a omezení CITE-seq

Výhody: CITE-seq umožňuje simultánní analýzu transkriptomu i proteomu jednotlivých buněk. Předchozí snahy o spojování měření indexového třídění z jednotlivých buněk se scRNA-seq byly omezeny na provozování malé velikosti vzorku a nebyly kompatibilní s multiplexováním a masivním paralelním vysoce výkonným sekvenováním. Ukázalo se, že CITE-seq je kompatibilní s vysoce výkonnými mikrofluidními platformami, jako je 10X Genomics a Drop sekv. Je také přizpůsobitelný pro platformy micro / nano-well. Spojení s hashováním buněk umožňuje aplikaci CITE-seq na hromadné vzorky a multiplexování vzorků. Tyto techniky pracují na snížení celkových nákladů na vysoce výkonné sekvenování u více vzorků. A konečně, CITE-seq lze upravit tak, aby detekoval malé molekuly, interferenci RNA, CRISPR a další techniky úpravy genů.

Omezení: Jedním z omezení CITE-Seq je ztráta informací o poloze. Vzhledem ke způsobu, jakým jsou buňky ošetřeny, není známa prostorová distribuce buněk ve vzorku, stejně jako proteinů v buňce.^[14][8] Kromě toho tato metoda sdílí výzvy scRNA-Seq, jako je vysoké množství šumu a možné výzvy při detekci slabě exprimovaných genů.^[8] Pokud jde o fenotypizaci, představuje optimalizace testu a protilátek také potenciální problém, pokud nejsou v současné době dostupné panely zahrnuty požadované proteiny.^[15] Navíc právě teď CITE-Seq není schopen detekovat intracelulární proteiny.^[15] Se současným protokolem existuje mnoho výzev, které by mohly nastat během kroku permeabilizace, čímž by se technika omezila na povrchové markery.

Alternativní metody

• REAP-seq: Peterson a kol. od společnosti Merck vyvinul techniku ​​podobnou CITE-seq nazvanou RNA Expression and Protein Sequencing Assay (REAP-seq). Zatímco REAP-seq, podobně jako CITE-seq, měří hladiny jak transkriptů, tak proteinů v jedné buňce, rozdíl mezi těmito dvěma technikami spočívá v tom, jak je protilátka konjugována s oligonukleotidy. CITE-seq typicky spojuje oligonukleotid s protilátkou nekovalentně konjugací streptavidinu s protilátkou a biotinovou konjugací s oligonukleotidem. REAP-seq kovalentně spojuje protilátku a aminovaný čárový kód DNA^[16]
• PLAYR: Test PLAYR nebo proximální ligace pro RNA využívá hmotnostní spektrometrii k současné analýze hladin transkriptomu a proteinu v jednotlivých buňkách. V této technice jsou proteiny i RNA transkripty značeny izotopově konjugovanými protilátkami a izotopově značenými sondami, což umožňuje jejich detekci na hmotnostním spektrometru^[17]

Reference