Automatická opravná svorka - Automated patch clamp

Automatické upínání patchů začíná[1] vyměnit manuál upnutí záplaty jako metoda měření elektrické aktivity jedince buňky. K automatizaci nahrávek patch clamp z buněk v se používají různé techniky buněčná kultura a in vivo. Tato práce pokračuje od konce 90. let výzkumnými laboratořemi a společnostmi, které se snaží snížit její složitost a náklady na ruční upínání patchů. Upínání záplat po dlouhou dobu bylo považováno za uměleckou formu a je stále velmi časově náročné a zdlouhavé, zejména in vivo. Techniky automatizace se snaží snížit chyby uživatelů a variabilitu při získávání kvality elektrofyziologie záznamy z jednotlivých buněk.

Ruční svorka

Hlavní článek: Patch svorka
alternativní text
Animace ukazující proces gigasealingu. Pipeta se blíží k buňce a oblak kapaliny vytékající z pipety vytváří na povrchu buňky malý důlek. Když se odpor dostatečně zvýšil, aplikuje se na pipetu, která táhne, malé množství sání buněčná membrána do kontaktu se špičkou pipety. Tím se vytvoří charakteristika těsnění gigaohm charakteristická pro záznam patch clampu.

Tradiční manuální metodu pro připojení svorky pomocí skleněných pipet vyvinula společnost Erwin Neher a Bert Sakmann a vyžadoval vysoce kvalifikovaného technika. Technik umístí skleněnou pipetu do blízkosti buňky a použije příslušné sání, aby vytvořil elektrické těsnění mezi pipetou a membránou buňky. Toto těsnění zajišťuje kvalitní záznam tím, že zabraňuje úniku jakéhokoli proudu mezi špičkou pipety a buněčnou membránou. Toto utěsnění se vytvoří, když se membrána buňky chemicky váže na špičku pipety, takže vnitřek pipety je spojen pouze s cytoplazma buňky. Toto spojení nebo těsnění z membrány a skla se nazývá „gigaseal“.[2]

Technik tradičně používal jejich ústa k zajištění přesných tlaků potřebných k jejich utěsnění do cely. Kromě kontroly tlaku musí technik také umístit pipetu přesně do správné vzdálenosti od buňky, aby s ní membrána utěsnila. Používat mikromanipulátor se pipeta pohybuje směrem k cele, dokud technik neuvidí změnu elektrického odporu mezi tekutinou uvnitř pipety a okolní tekutinou (viz animace). To obvykle vyžaduje 3–12 měsíců školení, než je technik schopen spolehlivě zaznamenávat z buněk. Technik v podstatě provádí vyvažovací úkon a snaží se sledovat a manipulovat s několika systémy současně (pohyb, tlak a elektrické signály). Pokud nebude každá část procesu provedena přesně a se správným načasováním, těsnění nebude vytvořeno správně a technik bude muset vyměnit pipetu a začít znovu.

Tyto výzvy snižují počet nahrávek, které může technik získat, a výrazně zvyšují náklady. Automatizace usiluje o snížení času, složitosti a nákladů na ruční upínání patchů.

Automatizační systémy

Technika automatizace se liší v závislosti na okolním prostředí buněk. U buněk in vivo to obvykle znamená, že jsou buňky v mozku a obklopeny jinými buňkami. Toto prostředí také obsahuje cévy, dendrity, axony, a gliové buňky což ztěžuje vytvoření gigasealu ucpáním špičky pipety o průměru 1–2 m. Zde hraje přesná kontrola tlaku a polohy na špičce pipety velkou roli v prevenci ucpání a detekci, zda je buňka blízko špičky pipety, jak je popsáno výše.

Buňky in vitro mohou být suspendovány v tekutině, připraveny k přilnutí na kultivační misku nebo zůstat součástí kousku tkáně, který byl ze zvířete odstraněn. Tato prostředí obvykle nemusí kompenzovat pohyb tkáně v důsledku srdečního rytmu nebo dýchání zvířete. V případě buněk v suspenzi je pipeta zcela nahrazena mikročipem s otvory, které mohou vytvářet gigaseal a měřit elektrickou aktivitu. Ucpávání je také méně problematické pro buňky nebo tkáně v kultivačních miskách, protože buňky a pipetu lze pozorovat mikroskopem, který technikovi pomáhá vyhnout se všemu kromě požadované buňky.

Každý z těchto automatizovaných systémů musí provádět několik úkolů. Musí umístit článek vedle špičky pipety nebo jiného zařízení s otvorem o velikosti 1–2 μm, kontrolovat tlak v otvoru a řídit napětí uvnitř článku.

In vivo

Jeden příklad upnutí náplasti in vivo ukázal Kodandaramaiah, et al.[3] V tomto případě se regulace tlaku skládala ze sady elektronických ventilů a elektronických regulátorů tlaku, které zajišťovaly tři tlaky, které dříve zajišťoval technik (vysoký tlak 800 - 1 000 mbar, nízký tlak 20 - 30 mbar a malé vakuum 15 - 150 mbar). Tři elektronické ventily přepínaly mezi třemi tlaky a atmosférickým tlakem. Vysoký tlak byl použit, aby se zabránilo ucpání pipety, nízký tlak byl použit při hledání buněk a vakuum bylo použito k procesu gigasealingu. Všechny byly řízeny počítačem, aby bylo možné volit mezi tlaky, jak se mění odpor na špičce pipety.

Ruční ovládání polohy bylo v tomto případě nahrazeno počítačem piezoelektrický mikromanipulátor který pohyboval pipetou v diskrétních 2–3 μm krocích do tkáně, dokud se nedostala do kontaktu s buňkou. Toto přesné ovládání je mnohem přesnější a opakovatelnější než ruční určování polohy a nevyžaduje obsluhu.

Počítač také vypočítává a sleduje změnu elektrického odporu při kontaktu pipety s buňkou. Vysílá napěťový signál ve formě čtvercové vlny dolů po pipetě, která buď vystupuje z konce pipety, nebo je blokována buněčnou membránou. Když to membrána zablokuje, počítač zastaví pohyb pipety a aplikuje sání, aby vytvořil gigaseal. Tato automatizace vylučuje rozhodování, které technik musel provádět, a na rozdíl od technika může počítač tyto úkoly provádět neúnavně a s větší přesností.

Všechny tyto kroky se provádějí ve stejné logické posloupnosti jako ruční upínání patchů, ale jejich provedení nevyžaduje rozsáhlé školení a jsou zcela řízeny počítačem. To snižuje výdaje potřebné k získání nahrávek patch clamp a zvyšuje opakovatelnost a robustnost záznamu v živém mozku.

V pozastavení

Schéma systému svorek náplasti používající kapičkovou suspenzní kulturu a gravitaci k umístění buněk nad pipetu. Sání uvnitř pipety přitáhne buňky ke špičce pipety, která pak vytvoří gigaseal.
alternativní text
Schéma čipu patch-clamp ukazující gigaseal, konfiguraci záznamu celé buňky a iontový kanál a proudy celé buňky.

Bylo vyvinuto mnoho typů systémů pro upínání buněk v suspenzních kulturách. Jeden systém používá tradiční pipetu a buňky v kapkové suspenzní kultuře k získání záznamů patch clamp (viz obrázek). To má další výhodu v použití tradičních systémů pro výrobu pipet, které ohřívají skleněnou kapiláru a podélně ji táhnou, aby se vytvořil zúžený hrot používaný při upínání náplastí.

Běžnější automatizační systémy pro suspenzní kultury používají mikročipy s malými (1–2 μm) otvory v planárním substrátu místo pipet k vytvoření gigaseal a záznamu z jednotlivých buněk. Patch čipy byly vyvinuty počátkem dvacátých let v důsledku vylepšení mikrofabrikace technologie vyvinuté polovodič průmysl. Čipy se obvykle vyrábějí z křemík, sklenka, PDMS, polyamid. Systémy patch čipů jsou obvykle složitější a nákladnější, ale mají další výhodu paralelního a hands-free provozu.[4][5][6]

Neurony obvykle nerostou v suspenzních kulturách, ale jiné typy buněk mohou. Některé mohou být transfektovaný s geny k vytvoření membrány iontové kanály zájmu. To znamená, že buňka, která normálně nemá elektrickou aktivitu, může ve své membráně růst iontové kanály, které budou generovat iontové proudy. Protože jsou buňky v suspenzních kulturách navzájem disociovány, lze iontové proudy v jedné buňce měřit s přesností. To vědcům umožňuje studovat chování iontových kanálů ve více kontrolovaných prostředích bez rušení proudů z jiných buněk, jak se obvykle vyskytuje v neuronových sítích. To je zvláště užitečné při screeningových studiích, kde cílem je specifický protein.[7] Protože manipulace s buňkami v suspenzi je mnohem snazší než manipulace s buňkami v kultuře nebo in vivo, lze tímto způsobem získat záznamy patch clamp mnohem rychleji a spolehlivěji, což zvyšuje produktivitu a umožňuje screening tisíců sloučenin.[8]

Neurony odvozené od kmenové buňky kultivované adherentně mohou být zvednuty do suspenze a byly úspěšně použity na planárních svorkách upínacích zařízení.[9] Ionové kanály jako např napěťově řízené sodíkové kanály, napěťově řízené draslíkové kanály a ionotropní ligandem řízené iontové kanály otevřel ligand GABA byly zaznamenány z těchto buněk pomocí automatizované a ruční svorky.[10]

V kultuře

Existuje mnoho metod in vitro pro automatické upínání náplastí kultivovaných buněk nebo řezů mozkové tkáně.

Jeden používá patchový čip, jako jsou ty diskutované výše, spolu s povrchovými úpravami, které způsobují, že kultivované buňky migrují do otvorů, kde se při růstu tvoří gigaseal.[11] Tím, že umožňují neuronům růst v kultuře, vytvářejí spontánně sítě, jako jsou ty v mozku, které jsou spíše jako přirozené tkáně než izolované buňky v suspenzi.

V jiné metodě jsou buňky odebrány ze zvířete a kultivovány na čipu náplasti po dobu 2–4 hodin, protože spontánně tvoří gigaseal s polyimid a PDMS opravné čipy [12] Tento systém nevyžaduje žádné externí zařízení k vytváření gigasealů.

Další technika automatizuje umisťování buněk upínajících náplast v kulturách. Využívá nanopipetu na precizním, piezoelektrickém stole ke skenování povrchu v kultivační misce. Při skenování udržuje konstantní elektrickou kapacitu mezi špičkou pipety a povrchem nebo buňkami pod ní pohybem nahoru a dolů. (Jak se pohybuje v blízkosti buňky, zvyšuje se kapacita, takže akční člen pohybuje pipetou pryč a naopak.) Tím se získá přesné topografické mapování povrchu v kultivační misce. Poté, co byly buňky mapovány, počítač přesune pipetu na vybranou buňku a spustí ji, aby s ní vytvořil gigaseal.[13]

Jiná technika jednoduše automatizuje podnikání při pečlivém kontaktu s buňkami. Operátor umístí pipetu na vzorek a poté nechá převzít automatizovaný software, spustí pipetu a snaží se detekovat zvýšení odporu na pipetě při kontaktu s buňkou. V tomto okamžiku proces končí a technik vytvoří gigaseal ručně.

Vývoj a přijetí

Patch-clamp automatizační přístrojové vybavení se stalo komerčně dostupným v roce 2003. Kvůli počátečním vysokým nákladům měla být tato téměř 20 let stará technologie původně určena pro biotechnologický a farmaceutický průmysl, ale v posledních letech její přítomnost roste v akademickém i neziskovém prostředí vzhledem k rostoucí ověřené technické spolehlivosti a relativní cenové dostupnosti. Rostoucí počet univerzit a dalších akademických institucí nyní disponuje laboratořemi a základními zařízeními vybavenými automatickými aparáty patch-clamp ve spojení a souběžně s dalšími přidruženými nebo doplňkovými technologiemi a metodami.[14] Přijetí a uznání automatizace patch-clamp elektrofyziologie se odráží v exponenciálním růstu vědecké literatury publikované s výsledky získanými touto revoluční novou technologií [15]

Reference

  1. ^ Wood, C .; Williams, C .; Waldron, G. J. (2004). Msgstr "Upínání záplat podle čísel". Objev drog dnes. 9 (10): 434–441. doi:10.1016 / S1359-6446 (04) 03064-8. PMID  15109948.
  2. ^ Hamill, O. P .; Marty, A .; Neher, E .; Sakmann, B .; Sigworth, F. J. (1981). "Vylepšené techniky patch-clamp pro záznam proudu s vysokým rozlišením z buněk a bezbuněčných membránových záplat". Archiv Pflügers: European Journal of Physiology. 391 (2): 85–100. CiteSeerX  10.1.1.456.107. doi:10.1007 / BF00656997. PMID  6270629.
  3. ^ Kodandaramaiah, Suhasa B; Franzesi, Giovanni Talei; Chow, Brian Y; Boyden, Edward S; Forest, Craig R (2012). „Automatizovaná elektrofyziologie neuronů neuronů in vivo v celé buňce“. Přírodní metody. 9 (6): 585–587. doi:10.1038 / nmeth.1993. ISSN  1548-7091. PMC  3427788. PMID  22561988.
  4. ^ Jones, K. A .; Garbati, N .; Zhang, H .; Large, C. H. (2009). Msgstr "Automatické upínání záplat pomocí QPatch". Vysoce výkonné prověřování. Metody v molekulární biologii. 565. 209–23. doi:10.1007/978-1-60327-258-2_10. ISBN  978-1-60327-257-5. PMID  19551364.
  5. ^ Chen, C. Y .; Tu, T. Y .; Chen, C.H .; Jong, D. S .; Wo, A. M. (2009). „Patch upnutí na rovném skle - výroba clony přesýpacích hodin a záznam iontového kanálu s vysokým výtěžkem“. Laboratoř na čipu. 9 (16): 2370–2380. doi:10.1039 / B901025D. PMID  19636469.
  6. ^ Obergrussberger, Alison; Stölzle-Feix, Sonja; Becker, Nadine; Brüggemann, Andrea; Fertig, Niels; Möller, Clemens (2015). „Nové screeningové techniky pro léky zaměřené na iontové kanály. Kanály. 9 (6): 367–375. doi:10.1080/19336950.2015.1079675. PMC  4850050. PMID  26556400.
  7. ^ Dunlop, J .; Bowlby, M .; Peri, R .; Vasilyev, D .; Arias, R. (2008). „High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology“. Recenze přírody Objev drog. 7 (4): 358–368. doi:10.1038 / nrd2552. PMID  18356919.
  8. ^ Obergrussberger, Alison; Brüggemann, Andrea; Goetze, Tom; Radedius, Markus; Haarmann, Claudia; Rinke, Ilka; Becker, Nadine; Dobře, Takayuki; Ohtsuki, Atsushi; Stengel, Timo; Vogel, Marius; Steindl, Jürgen; Mueller, Max; Stiehler, Johannes; George, Michael; Fertig, Niels (2016). „Automatizovaná propojovací svorka splňuje vysokovýkonný screening: 384 buněk zaznamenaných paralelně na planárním spojovacím modulu“. Journal of Laboratory Automation. 21 (6): 779–793. doi:10.1177/2211068215623209. PMID  26702021.
  9. ^ Haythornthwaite, Alison; Stölzle, Sonja; Hasler, Alexander; Kiss, Andrea; Mosbacher, Johannes; George, Michael; Brüggemann, Andrea; Fertig, Niels (2012). „Charakterizace lidských iontových kanálů v indukovaných neuronech odvozených z pluripotentních kmenových buněk“. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9): 1264–1272. doi:10.1177/1087057112457821. PMID  22923790.
  10. ^ Haythornthwaite, Alison; Stölzle, Sonja; Hasler, Alexander; Kiss, Andrea; Mosbacher, Johannes; George, Michael; Brüggemann, Andrea; Fertig, Niels (2012). „Charakterizace lidských iontových kanálů v indukovaných neuronech odvozených z pluripotentních kmenových buněk“. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9): 1264–1272. doi:10.1177/1087057112457821. PMID  22923790.
  11. ^ Py, C .; Martina, M .; Diaz-Quijada, G. A .; Luk, C. C .; Martinez, D .; Denhoff, M. W .; Charrier, A .; Comas, T .; Monette, R .; Krantis, A .; Syed, N. I .; Mealing, G. A. R. (2011). „Od porozumění buněčné funkci k novému objevu léčiv: Role technologie planárního čipu Patch-Clamp Array“. Hranice ve farmakologii. 2: 51. doi:10.3389 / fphar.2011.00051. PMC  3184600. PMID  22007170.
  12. ^ Martinez, D .; Py, C .; Denhoff, M. W .; Martina, M .; Monette, R .; Comas, T .; Luk, C .; Syed, N .; Mealing, G. (2010). „Vysoce věrné záznamy patch-clamp z neuronů kultivovaných na polymerním mikročipu“. Biomedicínské mikrozařízení. 12 (6): 977–985. CiteSeerX  10.1.1.362.9850. doi:10.1007 / s10544-010-9452-z. PMID  20694518.
  13. ^ Gorelik, J .; Gu, Y .; Spohr, H. A .; Shevchuk, A. I .; Lab, M. J .; Harding, S.E .; Edwards, C. R. W .; Whitaker, M .; Moss, G. W. J .; Benton, D. C. H .; Sánchez, D .; Darszon, A .; Vodyanoy, I .; Klenerman, D .; Korchev, Y. E. (2002). „Iontové kanály v malých buňkách a subcelulárních strukturách lze studovat pomocí inteligentního systému Patch-Clamp“. Biofyzikální deník. 83 (6): 3296–3303. Bibcode:2002BpJ .... 83,3296G. doi:10.1016 / S0006-3495 (02) 75330-7. PMC  1302405. PMID  12496097.
  14. ^ Picones, A .; Loza-Huerta, A .; Segura-Chama, P .; Lara-Figueroa, C.O. (2016). "Příspěvek automatizovaných technologií k objevování drog na iontovém kanálu". Adv Protein Chem Struct Biol. 104: 357–378. doi:10.1016 / bs.apcsb.2016.01.002. PMID  27038379.
  15. ^ Picones, A. (2015). „Ion kanály jako léčivé cíle biologických toxinů: dopad automatizované elektrofyziologie patch-clamp“. Curr Top Med Chem. 15 (7): 631–637. doi:10.2174/1568026615666150309145928. PMID  25751269.

externí odkazy