Celková vnitřní reflexní mikroskopie - Total internal reflection microscopy

Rozptyl evanescentního pole částicí sondy.

Celková vnitřní reflexní mikroskopie je specializovaná optická zobrazovací technika pro sledování a detekci objektů využívající světlo rozptýlené z postupné pole v blízkosti a dielektrikum rozhraní. Jeho výhody jsou vysoké odstup signálu od šumu a vysoké prostorové rozlišení ve svislé dimenzi.

Pozadí

Totální vnitřní odraz světla se vyskytuje na rozhraní mezi materiály s různými indexy lomu při dopadajících úhlech větších než kritický úhel, ${ displaystyle theta _ {c}}$, kde

${ displaystyle theta _ {c} = sin ^ {- 1} (n_ {2} / n_ {1})}$

a ${ displaystyle n_ {1}}$ je index dopadajícího média a ${ displaystyle n_ {2}}$ index přenosového média a ${ displaystyle theta _ {c}}$ se měří od normálu k rozhraní.

Za podmínek úplného vnitřního odrazu má elektromagnetické pole v přenosovém médiu podobu postupná vlna, jehož intenzita ${ displaystyle I (z)}$ se exponenciálně rozpadá se vzdáleností od rozhraní tak, že

${ displaystyle I (z) = I_ {0} e ^ {- beta z}}$

s ${ displaystyle beta = { frac {4 pi} { lambda}} { sqrt {(n_ {1} sin ( theta)) ^ {2} -n_ {2} ^ {2}}} }$. Z praktických důvodů se jako přenosové médium často volí tekutina - obvykle voda -, do které lze ponořit mikroskopický předmět. Pokud se objekt přiblíží k rozhraní, očekává se, že rozptýlí světlo úměrné intenzitě pole v jeho výšce, ${ displaystyle z}$.^[1] Jelikož hloubka pronikání evanescentního pole je řádově stovek nanometrů, patří tato technika k nejcitlivějším pro sledování posunů ve směru kolmém na povrch.^[2]

Aplikace

Zobrazování

Tenká excitační oblast evanescentního pole umožňuje zobrazování širokého pole vybrané oblasti vzorku s vysokou odstup signálu od šumu. Spíše než spoléhat se na optický rozptyl se však do vzorku často zavádějí fluorofory pro selektivnější vizualizaci v biologických aplikacích. Tato populární zobrazovací technika je známá jako Celková interní reflexní fluorescenční mikroskopie.

Sledování částic

Pomocí kalibrované postupné vlny^[1] polohu koloidní částice nebo mikroskopické sondy lze sledovat s přesností nanometrů sledováním intenzity světla rozptýleného pomocí frustrovaný celkový vnitřní odraz. Poté lze získat podrobnou dynamiku sondy nebo částice, a to buď v tepelné rovnováze, nebo v nerovnovážných podmínkách.

Například shromažďováním časově nezávislého rozdělení pravděpodobnosti polohy části sondy v tepelné rovnováze a převrácením Maxwell – Boltzmannova distribuce,

${ displaystyle p (z) = { frac {1} {Z}} e ^ {- { frac {V (z)} {kT}}}}$,

kde ${ displaystyle Z}$ je funkce oddílu, a ${ displaystyle k}$ the Boltzmannova konstanta, lze získat potenciální energetický profil interakcí mezi částicemi a povrchem.^[3] Tímto způsobem mohou být detekovány subpikoNewtonovy síly.^[4]

Na druhou stranu lze difuzní dynamiku buňky nebo koloidu odvodit z její časové řady pozic získané pomocí TIRM nebo jiného sledování částic metoda. Hydrodynamické vazebné účinky vedoucí k redukci částic difúze v blízkosti pevného rozhraní byly studovány tímto způsobem.^[5]

Viz také

Celková interní reflexní fluorescenční mikroskopie

Evanescentní vlna

Totální vnitřní odraz

Mikroskopie tmavého pole

Reference