Špenátový aptamer - Spinach aptamer

Potřeba fluorescenčního sledování RNA růže, protože její role ve složitých buněčných funkcích se rozrostla nejen na mRNA, rRNA, a tRNA, ale také RNAi, siRNA, snoRNA, a lncRNA, mezi ostatními.[1][2] Špenát je synteticky odvozený RNA aptamer, který vznikl z potřeby způsobu studia role RNA na buněčné úrovni.[3] Tento aptamer byl vytvořen pomocí Systematic Evolution for Ligands pomocí EXponential enrichment, nebo SELEX, který je také známý jako in vitro evoluce.[4]

Metoda SELEX použitá pro návrh RNA aptameru Spianch.

Aptamer byl navržen tak, aby byl napodobeninou RNA zelený fluorescenční protein (GFP); podobně jako GFP pro proteiny, lze špenát použít pro fluorescenční značení RNA a její sledování in vivo. Způsob inzerce špenátové sekvence po požadované sekvenci RNA je snadno dostupný.[5][6]

GFP fluorofor je tvořen třemi cyklizovanými aminokyselinami ve struktuře beta-barelu: Serine65-Tyrosine66-Glycine67. Tato struktura, 4-hydroxybenzliden imidazolinon (HBI), byla základem pro syntetický analog použitý ve studiích SELEX. Mnoho derivátů této struktury bylo testováno pomocí SELEXu, ale vybraný fluorofor, 3,5-difluor-4-hydroxybenzyliden imidazolinon (DFHBI), vykazoval nejlepší selektivní fluorescenci s vysokou kvantový výnos (0,72) když je vázán na sekvenci RNA 24-2, považuje se to za špenát.

RNA aptamer Špenát. PDB: 4KZD
Krystalová struktura špenátu PDB: 4KZD [1]

Bylo zjištěno, že DFHBI váže špenát pouze ve formě fenolátu. Při pH <6,0 jsou detekovány jak fenolické, tak fenolátové formy. Při pH = 6,0 je detekován pouze fenolátový pík. DFHBI je také neuvěřitelně robustní a odolává fotobělení po dlouhou dobu ve srovnání s HBI a EGFP. Předpokládá se, že volná výměna vázaného a nevázaného ligandu umožňuje tuto perzistenci. Vzhledem k tomu, že fluorofor GFP a jeho deriváty jsou kovalentně vázány na / část proteinu, nemůže dojít k volné výměně, a tedy k výsledkům bělení.

Špenát je 84-nukleotidová struktura se dvěma spirálovými vlákny a vnitřní boulí s a G-quadruplex motiv. Právě v tomto G-kvadruplexu se fluorofor váže. Na základě krystalografických údajů dochází k masivnímu přeskupení sousedních bází, jakmile se fluorofor váže, aby se přizpůsobil molekule. Tato vazba je však příznivá, protože podporuje stohování základny v normálně nestabilní oblasti, tj. Vnitřní boule. Podobně jako GFP je DFHBI také dehydratován, což by pomohlo s jeho vysokým kvantovým výtěžkem.

Špenát byl také upraven pro snímání proteinů nebo molekul in vivo. Upravená struktura, která zahrnuje dvě vazebná místa, omezuje fluorescenci aptameru na (1) fluorofor a (2) protein nebo malou molekulu.

Reference

  1. ^ http://www.umassmed.edu/rti/biology/role-of-rna-in-cells/
  2. ^ http://www.umassmed.edu/rti/biology/role-of-rna-protein-in-synthesis/
  3. ^ Huang, H .; Suslov, N.B .; Li, N.S .; Shelke, S.A .; Evans, M.E .; Koldobskaya, Y .; Rice, P.A .; Piccirilli, J.A. (Srpen 2014). „RNA obsahující G-kvadruplex aktivuje fluorescenci v fluoroforu podobném GFP.“ (2014) ". Nat. Chem. Biol. 10 (8): 686–691. doi:10.1038 / nchembio.1561. PMC  4104137. PMID  24952597.
  4. ^ Levine, HA; Nilsen-Hamilton, M (2007). „Matematická analýza SELEXU“. Výpočetní biologie a chemie. 31 (1): 11–35. doi:10.1016 / j.compbiolchem.2006.10.002. PMC  2374838. PMID  17218151.
  5. ^ Strack, Rita L; Disney, Matthew D; Jaffrey, Samie R (2013). „Super složená špenát2 odhaluje dynamickou povahu trinukleotidové RNA obsahující repetice“. Přírodní metody. 10 (12): 1219–1224. doi:10.1038 / nmeth.2701. ISSN  1548-7091. PMC  3852148. PMID  24162923.
  6. ^ Paige, J. S .; Wu, K. Y .; Jaffrey, S. R. (2011). "RNA napodobuje zelený fluorescenční protein". Věda. 333 (6042): 642–646. Bibcode:2011Sci ... 333..642P. doi:10.1126 / science.1207339. ISSN  0036-8075. PMC  3314379. PMID  21798953.

externí odkazy