SOS chromotest - SOS chromotest

Přehled použití odpovědi SOS pro testování genotoxicity

The SOS chromotest je biologický test k posouzení genotoxický potenciál chemických sloučenin. Test je kolorimetrický test, který měří expresi genů vyvolanou genotoxickými látkami v Escherichia coli, pomocí fúze se strukturním genem pro β-galaktosidáza. Test se provádí během několika hodin ve sloupcích 96jamkové mikrodestičky se zvyšující se koncentrací testovaných vzorků. Tento test byl vyvinut jako praktický doplněk nebo alternativa k tradičnímu Amesův test test na genotoxicita, který zahrnuje pěstování bakterií na agarových plotnách a porovnání rychlostí přirozených mutací s rychlostmi mutací bakterií vystavených potenciálně mutagenním sloučeninám nebo vzorkům. SOS chromotest je srovnatelný v přesnosti a citlivosti se zavedenými metodami, jako je Amesův test, a je užitečným nástrojem k screeningu genotoxických sloučenin, které by se u lidí mohly ukázat jako karcinogenní, za účelem vyčlenění chemikálií pro další hloubkovou analýzu.[1][2]

Stejně jako u jiných testů bakteriální gentoxicity a mutagenity mohou být sloučeniny vyžadující metabolickou aktivaci pro aktivitu zkoumány přidáním extraktu mikrozomálních jater z krys.

Mechanismus

The SOS odpověď hraje ústřední roli v reakci E-coli na genotoxické sloučeniny, protože reaguje na širokou škálu chemických látek. Spuštění tohoto systému může a bylo použito jako časný signál poškození DNA. V odpovědi SOS hrají klíčovou roli dva geny: lexA kóduje represor pro všechny geny v systému a recA kóduje protein schopný štěpit represor LexA po aktivaci signálem vyvolávajícím SOS (způsobený v tomto případě přítomností genotoxická sloučenina). Přestože přesný mechanismus reakce SOS stále není znám, je indukován, když poškození DNA narušuje nebo zastavuje replikaci DNA. .[3]

Možné ukazatele spouštění systému SOS jsou různé koncové body; aktivace proteinu RecA, štěpení represoru LexA, exprese kteréhokoli z genů SOS atd. Jeden z nejjednodušších testů spočívá v monitorování exprese genu SOS fúzí s lacZ, strukturním genem pro E-coli β-galaktosidáza.

Postup

Přehled použití odpovědi SOS pro testování genotoxicity

SOS chromotest spočívá v inkubaci E-coli s rostoucí koncentrací testované chemikálie. Po uplynutí času pro syntézu proteinů se aktivita β-galaktosidázy testuje pomocí jednoduchého kolorimetrického testu. Zahrnutím analogu laktózy, který při degradaci získá zbarvenou sloučeninu, se jako metrika použije snadno pozorovatelná nebo kvantifikovatelná změna barvy. Protože testovaná chemická látka může inhibovat syntézu proteinů při vyšších koncentracích, což by vedlo k podhodnocení indukce B-galaktosidázy, testuje se současně s β-galaktosidázou alkalická fosfatáza, aby bylo možné měřítko dat přežít.

Test lze snadno dokončit za několik hodin. Pokud se používá čtečka mikrodestiček, je test kvantitativní a křivky reakce na dávku mají počáteční lineární oblast. Sklon této lineární oblasti umožňuje jednoznačnou asociaci každé sloučeniny s jediným parametrem, SOS-indukující účinností (SOSIP), která odráží indukční aktivitu sloučeniny.[4]


Tento test poskytuje jak kvalitativní (viditelné pozorování barevného gradientu) pro účely screeningu, tak kvantitativní měření (spektrofotometrii) pro výpočet běžně přijímaných metrik. V kvantitativním testu je vynesena dávka-odezva (produkce barev spojená s produkcí beta-galaktosidázy) sloučeniny, přičemž sklon univerzální lineární oblasti použité jako univerzální parametr, SOS-indukující účinnost (SOSIP), která odráží schopnost sloučeniny indukovat SOS reakci (měřeno nepřímo produkcí beta-galaktosidázy a rozpadem analogu laktózy). Typicky je analogem laktózy X-Gal, který po odštěpení beta-galaktosidázou produkuje modrou barvu. Odezva na dávku se rovněž mění podle přežití buněk, měřeno rozkladem alkalické fosfatázy (která produkuje žluté zbarvení), což umožňuje výpočet SOSIP.

Přestože je SOSIP metrika založená na koncentraci, lze stejnou metodu použít pro složité směsi prostředí, kde není známa koncentrace nebo dokonce požadované sloučeniny. Prostřednictvím výpočtu přechodného SOS-indukčního faktoru (SOSIF), který lze vynést proti zředění stejným způsobem, aby bylo možné ilustrovat dávkovou odezvu bez předchozího analytického měření vzorků.

Výhody

SOS chromotest je považován za nejjednodušší a nejrychlejší krátkodobý test genotoxicity. Slouží jako užitečný a nákladově efektivní doplněk tradičního Amesova testu z mnoha důvodů. Za prvé, díky své jednoduchosti a rychlosti může být SOS chromotest použit jako screeningový test pro velké množství potenciálně genotoxických sloučenin. Zadruhé může umožnit detekci genotoxických chemikálií, které v Amesově testu vedou k falešným negativům (jako je estradiol, sloučenina vzbuzující obavy). Za třetí, může se ukázat jako efektivní metoda pro diskriminaci falešně pozitivních výsledků v Amesově testu.

Reference

  1. ^ Mohn GR (září 1981). "Bakteriální systémy pro testování karcinogenity". Mutat. Res. 87 (2): 191–210. doi:10.1016/0165-1110(81)90032-4. PMID  6799816.
  2. ^ Nákup IF (červenec 1982). „Mezinárodní komise pro ochranu před environmentálními mutageny a karcinogeny. Pracovní dokument ICPEMC 2/6. Posouzení prediktivních testů na karcinogenitu“. Mutat. Res. 99 (1): 53–71. doi:10.1016/0165-1110(82)90031-8. PMID  6811893.
  3. ^ Quillardet, Hofnung (1993). "SOS Chromotest: recenze". Mutační výzkum. 297 (3): 235–279. doi:10.1016 / 0165-1110 (93) 90019-j. PMID  7692273.
  4. ^ Quillardet P, Huisman O, D'Ari R, Hofnung M (říjen 1982). „SOS chromotest, přímý test indukce funkce SOS v Escherichia coli K-12 k měření genotoxicity“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79 (19): 5971–5. Bibcode:1982PNAS ... 79.5971Q. doi:10.1073 / pnas.79.19.5971. PMC  347033. PMID  6821127.