Periodická protiproudá chromatografie - Periodic counter-current chromatography

Periodická protiproudá chromatografie (PCC) je metoda pro běh afinitní chromatografie kvazi spojitým způsobem. Dnes se tento postup používá hlavně k čištění protilátek v biofarmaceutické průmysl[1] stejně jako ve výzkumu a vývoji. Při čištění protilátek Protein A se používá jako afinitní matice. Periodické protiproudové procesy však lze použít na jakoukoli chromatografii afinitního typu.[2]

Základní princip

V konvenčním afinitní chromatografie, jedna chromatografická kolona je naplněna přiváděným materiálem až do bodu, než již nemůže být cílový materiál (produkt) zadržen afinitním materiálem. Pryskyřice s adsorbovaným produktem je poté promyta, aby se odstranily nečistoty. Nakonec je čistý produkt eluován jiným pufrem. Je pozoruhodné, že pokud se na kolonu vloží příliš mnoho přiváděného materiálu, produkt může prorazit a produkt se následně ztratí. Proto je velmi důležité sloupec načíst pouze částečně, aby se maximalizoval výtěžek.

Procesní diagram pro 2sloupcový periodický proces protiproudu "CaptureSMB".

Periodická protiproudá chromatografie staví tento problém stranou tím, že využívá více než jeden sloupec. Procesy PCC lze spustit s libovolným počtem sloupců, počínaje dvěma.[3] Následující odstavec vysvětlí dvousloupcovou verzi PCC, ale ostatní protokoly s více sloupci se spoléhají na stejné principy (viz níže). Schéma znázorňující jednotlivé kroky procesu je zobrazeno vpravo. V kroku 1, takzvané fázi postupného načítání, jsou sloupce 1 a 2 propojeny. Sloupec 1 je plně naložen vzorkem (červený), zatímco jeho průlom je zachycen na sloupci 2. V kroku 2 je sloupec 1 promyt, eluován, vyčištěn a znovu ekvilibrován, zatímco na sloupci 2 pokračuje samostatné oddělování. V kroku 3 po regeneraci sloupec 1, sloupce jsou opět vzájemně propojeny a sloupec 2 je plně naložen, zatímco jeho průlom je zachycen na sloupci 1. Nakonec se v kroku 4 sloupec 2 promyje, eluuje, čistí a znovu ekvilibruje, zatímco načítání pokračuje nezávisle na sloupci 1. Tento cyklický proces se opakuje kontinuálním způsobem.

Existuje několik variací periodické protiproudé chromatografie s více než dvěma sloupci. V těchto případech jsou další sloupce umístěny do proudu zdroje během načítání, což má stejný účinek jako použití delších sloupců. Alternativně lze další sloupce během načítání udržovat v neobsazeném pohotovostním režimu. Tento režim nabízí další záruku, že hlavní proces není ovlivněn protokoly praní a čištění, i když v praxi je to zřídka vyžadováno. Na druhé straně nevyužívané sloupce snižují teoretickou maximální produktivitu pro takové procesy. Obecně jsou výhody a nevýhody různých vícesloupcových protokolů předmětem debaty[4]. Bezpochyby však ve srovnání s dávkovými procesy s jedním sloupcem poskytují periodické protiproudé procesy výrazně vyšší produktivitu.

Dynamické řízení procesu

Mechanismy dynamického řízení procesu pro periodickou protiproudou chromatografii.

Na časové škále průběhů kontinuální chromatografie je poměrně běžné pozorovat změny v důležitých parametrech procesu, jako je stav kolony, kvalita pufru, titr krmiva (koncentrace) nebo složení krmiva. Takové změny vedou ke změně maximální kapacity kolony v poměru k množství vloženého vstupního materiálu. Aby se dosáhlo stálé kvality a výtěžku pro každý procesní cyklus, je třeba upravit načasování jednotlivých kroků procesu. Ruční změny jsou v zásadě myslitelné, ale spíše nepraktické. Dynamičtější algoritmy řízení procesu běžněji sledují parametry procesu a podle potřeby automaticky provádějí změny.

V současnosti se používají dva různé provozní režimy pro dynamické procesní regulátory (viz obrázek vpravo). První, nazývaný DeltaUV, sleduje rozdíl mezi dvěma signály z detektorů umístěných před a za prvním sloupcem. Během počátečního načítání existuje velký rozdíl mezi těmito dvěma signály, ale zmenšuje se, když nečistoty procházejí kolonou. Jakmile je kolona plně nasycena nečistotami a je zadržován pouze další produkt, dosahuje rozdíl mezi signály konstantní hodnoty. Dokud je produkt zcela zachycen na koloně, rozdíl mezi signály zůstane konstantní. Jakmile některý z produktů prolomí sloupec (srovnej výše), rozdíl se zmenší. Lze tedy určit načasování a míru průniku produktu. Druhá možnost, zvaná AutomAb, vyžaduje pouze signál jediného detektoru umístěného za prvním sloupcem. Během počátečního načítání se signál zvyšuje, protože kolonou prochází stále více nečistot. Když je kolona nasycena nečistotami a pokud je produkt na koloně zcela zachycen, signál poté zůstává konstantní. Jakmile některý z produktů prorazí sloupec (srovnej výše), signál se opět zvýší. Lze tedy znovu určit načasování a míru průniku produktu.

Obě iterace fungují teoreticky stejně dobře. V praxi požadavek na dva synchronizované signály a vystavení jednoho detektoru nepurifikovanému vstupnímu materiálu činí přístup DetailUV méně spolehlivým než AutomAb.

Obchodní situace

Od roku 2017 GE Healthcare drží patenty kolem třísloupcové periodické protiproudé chromatografie: tato technologie se používá v jejich Äkta PCC nástroj.[Citace je zapotřebí ] Podobně ChromaCon drží patenty pro optimalizovanou dvousloupcovou verzi (CaptureSMB).[Citace je zapotřebí ] CaptureSMB se používá v ChromaCon je Contichrom CUBE a na základě licence v YMC je Ecoprime Twin systémy. Mezi další výrobce systémů schopných periodické protiproudé chromatografie patří Novasep a Pall.[Citace je zapotřebí ]

Reference

  1. ^ Warikoo, Veena; Godawat, Rahul; Brower, Kevin; Jain, Sujit; Cummings, Daniel; Simons, Elizabeth; Johnson, Timothy; Walther, Jason; Yu, Marcella; Wright, Benjamin; McLarty, Jean; Karey, Kenneth P .; Hwang, Chris; Zhou, Weichang; Riske, Frank; Konstantinov, Konstantin (prosinec 2012). "Integrovaná kontinuální produkce rekombinantních terapeutických proteinů". Biotechnologie a bioinženýrství. 109 (12): 3018–3029. doi:10,1002 / bit. 24884.
  2. ^ Godawat, Rahul; Brower, Kevin; Jain, Sujit; Konstantinov, Konstantin; Riske, Frank; Warikoo, Veena (prosinec 2012). "Periodická protiproudá chromatografie - návrh a provozní úvahy pro integrované a kontinuální čištění proteinů". Biotechnology Journal. 7 (12): 1496–1508. doi:10.1002 / biot.201200068.
  3. ^ Angarita, Monica; Müller-Späth, Thomas; Baur, Daniel; Lievrouw, Roel; Lissens, Geert; Morbidelli, Massimo (duben 2015). „Twin-kolona CaptureSMB: Nový cyklický proces pro afinitní chromatografii na proteinu A“. Journal of Chromatography A. 1389: 85–95. doi:10.1016 / j.chroma.2015.02.046.
  4. ^ Baur, Daniel; Angarita, Monica; Müller-Späth, Thomas; Steinebach, Fabian; Morbidelli, Massimo (červenec 2016). "Srovnání vsázkových a kontinuálních vícesloupcových proteinových A procesů zachycení optimálním designem". Biotechnology Journal. 11 (7): 920–931. doi:10.1002 / biot.201500481. PMID  26992151.