Mikroskopie interferenčního odrazu - Interference reflection microscopy
Mikroskopie interferenčního odrazu (IRM) je optická mikroskopie technika, která využívá polarizované světlo k vytvoření obrazu předmětu na skleněné ploše. The intenzita signálu je míra blízkosti objektu k povrchu skla. Tuto techniku lze použít ke studiu událostí na buněčné membráně bez použití (fluorescenční) značky na rozdíl od Mikroskopie TIRF.
Dějiny
Tato metoda byla poprvé použita ke studiu tenkých vrstev ropy.[1][2] V roce 1964 zavedl Curtis první aplikaci této techniky v buněčné biologii ke studiu fibroblastů embryonálního kuřecího srdce.[3] Pomocí IRM se podíval na místa adheze a vzdálenosti fibroblastů, přičemž si všiml, že kontakt se sklem byl většinou omezen na okraj buňky a pseudopodia.[3]
Tato technika byla vylepšena a kvalitativní a kvantitativní aspekty této techniky byly později popsány několika výzkumníky v 70. a 80. letech:[4] Bereiter-Hahn a jeho kolegové tuto techniku korelovali elektronová mikroskopie, což ukazuje, že různé savčí buněčné linie ulpívají na skleněném substrátu ve specifických ohniskových adhezních místech.[5]
Teorie
Chcete-li vytvořit obraz připojené buňky, světlo konkrétního vlnová délka prochází a polarizátor. Toto lineární polarizované světlo se odráží a rozdělovač paprsků směrem k objektivní, která zaměřuje světlo na vzorek. Skleněný povrch je do určité míry reflexní a bude odrážet polarizované světlo. Světlo, které není odraženo sklem, bude cestovat do buňky a bude odráženo buněčnou membránou. Mohou nastat tři situace. Nejprve, když je membrána blízko skla, odražené světlo ze skla se posune o polovinu vlnové délky, takže světlo odražené od membrány bude mít fázový posun ve srovnání s odraženým světlem ze skla fáze a proto se navzájem ruší (rušení ). Výsledkem tohoto rušení je tmavý pixel ve výsledném obrázku (na obrázku levý případ). Zadruhé, když membrána není připojena ke sklu, odraz od membrány má menší fázový posun ve srovnání s odraženým světlem ze skla, a proto se navzájem nezruší, což má za následek jasný pixel v obrazu ( správný případ na obrázku). Zatřetí, pokud není vzorek, detekuje se pouze odražené světlo ze skla a v konečném obrazu se objeví jako jasné pixely.
Odražené světlo bude cestovat zpět do rozdělovače paprsků a projde druhým polarizátorem, který eliminuje rozptýlené světlo, než dosáhne detektoru (obvykle CCD kamera ) za účelem vytvoření konečného obrázku. Polarizátory mohou zvýšit účinnost snížením rozptýleného světla; v moderním nastavení s citlivým digitálním fotoaparátem však nejsou požadovány.[6]
Teorie
Odraz je způsoben změnou indexu lomu, takže na každé hranici se odráží část světla. Míra odrazu je dána koeficientem odrazu , podle následujícího pravidla:[4]
Odrazivost je poměr intenzity odraženého světla () a intenzita přicházejícího světla ():[4]
Použití typických indexů lomu skla (1,50 - 1,54, viz seznam ), voda (1,31, viz seznam ), buněčná membrána (1,48)[7] a cytosol (1,35),[7] lze vypočítat zlomek světla odraženého každým rozhraním. Množství odrazu se zvyšuje s rostoucím rozdílem mezi indexy lomu, což vede k velkému odrazu od rozhraní mezi povrchem skla a kultivačním médiem (přibližně stejné jako voda: 1,31 - 1,33). To znamená, že bez buňky bude obraz jasný, zatímco když je buňka připojena, rozdíl mezi médiem a membránou způsobí velký odraz, který je mírně posunut ve fázi, což způsobí interferenci se světlem odraženým od skla. Protože se amplituda světla odraženého od rozhraní střední membrány snižuje kvůli rozptylu, připojená oblast bude vypadat tmavší, ale ne úplně černá. Protože kužel světla zaměřený na vzorek vede k různým úhlům dopadajícího světla, existuje široká škála interferenčních vzorů. Když se vzory liší o méně než 1 vlnovou délku (třásně nultého řádu), vzory se sbíhají, což vede ke zvýšené intenzitě. Toho lze dosáhnout použitím objektivu s numerickou aperturou větší než 1.[4]
Požadavky
Aby bylo možné zobrazovat buňky pomocí IRM, potřebuje mikroskop alespoň následující prvky: 1) světelný zdroj, jako je halogenová lampa, 2) optický filtr (který prochází malým rozsahem vlnových délek) a 3) rozdělovač paprsků (který odráží 50% a přenáší 50% zvolené vlnové délky)
Světelný zdroj musí produkovat světlo s vysokou intenzitou, protože mnoho světla bude ztraceno děličem paprsků a samotným vzorkem. Různé vlnové délky vedou k různým snímkům IRM; Bereiter-Hahn a kolegové ukázali, že pro jejich buňky PtK 2 vedlo světlo s vlnovou délkou 546 nm k lepšímu kontrastu než modré světlo s vlnovou délkou 436 nm.[5] V základní teorii IRM bylo provedeno mnoho vylepšení, z nichž většina zvyšuje účinnost a výtěžek tvorby obrazu. Umístěním polarizátorů a čtvrtvlnná deska mezi rozdělovačem paprsků a vzorkem lze převést lineární polarizované světlo kruhové polarizované světlo a poté převést zpět na lineární polarizované světlo, což zvyšuje účinnost systému. The kruhový polarizátor tento proces podrobně popisuje. Navíc zahrnutím druhého polarizátoru, který je ve srovnání s prvním polarizátorem otočený o 90 °, lze zabránit rozptýlenému světlu v dosažení detektoru, což zvyšuje poměr signálu k šumu (viz obrázek 2 Verschueren[4]).
Biologické aplikace
Existuje několik způsobů, jak lze IRM použít ke studiu biologických vzorků. Rané příklady použití techniky zaměřené na buněčná adheze[3] a migrace buněk.[8]
Fúze vezikul
V poslední době byla tato technika použita ke studiu exocytóza v chromafinové buňky.[6] Při zobrazení pomocí DIC se chromafinové buňky objevují jako kulaté buňky s malými výčnělky. Když je stejná buňka zobrazena pomocí IRM, stopu buňky na skle lze jasně vidět jako tmavou oblast s malými výčnělky. Když se vezikuly spojí s membránou, vypadají jako malé světlé kruhy v tmavé stopě (světlé skvrny v horní buňce v pravém panelu).
Příklad fúze vezikul v chromafinových buňkách pomocí IRM je uveden ve filmu 1. Po stimulaci 60mM draslík se uvnitř tmavé stopy chromafinové buňky začíná objevovat několik světlých skvrn v důsledku exocytózy husté granule jádra. Protože IRM nevyžaduje fluorescenční štítek, lze jej kombinovat s jinými zobrazovacími technikami, jako je např epifluorescence a mikroskopii TIRF ke studiu dynamiky proteinů spolu s exocytózou vezikul a endocytózou. Další výhoda nedostatku fluorescenčních značek je snížena fototoxicita.
Reference
- ^ Filler TJ, Peuker ET (duben 2000). „Reflexní kontrastní mikroskopie (RCM): zapomenutá technika?“. The Journal of Pathology. 190 (5): 635–8. doi:10.1002 / (SICI) 1096-9896 (200004) 190: 5 <635 :: AID-PATH571> 3.0.CO; 2-E. PMID 10727991.
- ^ Vašíček A (srpen 1961). "Teorie odrazu světla od tenkého absorbujícího filmu naneseného na kov". Optika a spektroskopie. 11: 128. Bibcode:1961OptSp..11..128V.
- ^ A b C Curtis AS (únor 1964). „MECHANISMUS ADHEZE BUNK NA SKLO: Studie pomocí interferenční reflexní mikroskopie“. The Journal of Cell Biology. 20 (2): 199–215. doi:10.1083 / jcb.20.2.199. PMC 2106393. PMID 14126869.
- ^ A b C d E Verschueren H (duben 1985). "Interferenční reflexní mikroskopie v buněčné biologii: metodologie a aplikace". Journal of Cell Science. 75 (1): 279–301. PMID 3900106.
- ^ A b Bereiter-Hahn J, Fox CH, Thorell B (září 1979). „Kvantitativní reflexní kontrastní mikroskopie živých buněk“. The Journal of Cell Biology. 82 (3): 767–79. doi:10.1083 / jcb.82.3.767. PMC 2110483. PMID 389938.
- ^ A b Wu MM, Llobet A, Lagnado L (listopad 2009). "Volná vazba mezi vápníkovými kanály a místy exocytózy v chromafinových buňkách". The Journal of Physiology. 587 (Pt 22): 5377–91. doi:10.1113 / jphysiol.2009.176065. PMC 2793871. PMID 19752110.
- ^ A b Dunn, Andrew Kenneth (1997). "Struktura buněk". Vlastnosti buněk rozptylující světlo (Disertační práce). University of Texas v Austinu. OCLC 39949488. Citováno 23. února 2010.
- ^ Godwin SL, Fletcher M, Burchard RP (září 1989). "Interferenční reflexní mikroskopická studie míst asociace mezi klouzavými bakteriemi a skleněnými substráty". Journal of Bacteriology. 171 (9): 4589–94. doi:10.1128 / jb.171.9.4589-4594.1989. PMC 210255. PMID 2768185.
Další čtení
- Kvantitativní reflexní interferenční kontrastní mikroskopie (RICM) v měkké hmotě a buněčné adhezi, Laurent Limozin a Kheya Sengupta, ChemPhysChem 2009, 10, 2752 - 2768