Technologie brány - Gateway Technology

The Klonovací systém brány, vynalezl a komercializoval Invitrogen od konce 90. let je metoda molekulární biologie, která umožňuje vědcům efektivně přenášet fragmenty DNA mezi nimi plazmidy pomocí patentované sady rekombinačních sekvencí, stránek "Gateway att" a dvou patentovaných směsí enzymů, nazývaných "LR klonáza" a "BP klonáza". Gateway Cloning Technique umožňuje přenos fragmentů DNA mezi různými klonovacími vektory při zachování čtecí rámec. Pomocí brány lze klonovat subklon DNA segmenty pro funkční analýzu. Systém vyžaduje počáteční vložení fragmentu DNA do plazmidu se dvěma přilehlými rekombinačními sekvencemi zvanými „att L1“ a „att L2“, aby se vytvořil „klon vstupní brány“ (speciální názvosloví Invitrogen).

Velké archivy klonů Gateway Entry, které obsahují převážnou většinu lidských, myších a potkaních ORF (otevřené čtecí rámce ) byly klonovány z člověka cDNA knihovny nebo chemicky syntetizovány na podporu výzkumné komunity pomocí NIH (National Institutes of Health) financování (např. Mammalian Gene Collection, http://mgc.nci.nih.gov/ ). Dostupnost těchto genových kazet ve standardním klonovacím plazmidu Gateway pomáhá vědcům rychle přenést tyto kazety na plazmidy, které usnadňují analýzu genové funkce. Klonování brány zabere více času pro počáteční nastavení a je dražší než tradiční metody klonování založené na restrikčních enzymech a ligázách, ale šetří čas a nabízí jednodušší a vysoce efektivní klonování pro následné aplikace.

Tato technologie byla široce přijata výzkumnou komunitou pro vědu o živé přírodě, zejména pro aplikace, které vyžadují přenos tisíců fragmentů DNA do jednoho typu plazmidu (např. Ten, který obsahuje promotor CMV pro expresi proteinu v buňkách savců), nebo pro přenos jeden fragment DNA do mnoha různých typů plazmidů (např. pro expresi bakteriálních, hmyzích a savčích proteinů).

Základní kroky

Prvním krokem v klonování brány je příprava klonu vstupní brány. Vstupní klony se často vyrábějí ve dvou krocích:

1) Sekvence „Gateway attB1 a attB2“ se přidají na 5 'a 3' konec genového fragmentu pomocí genově specifických primerů PCR a PCR - zesílení;

2) PCR amplifikační produkty jsou poté smíchány se speciálními plazmidy nazvané Gateway „Donorové vektory“ (nomenklatura Invitrogen) a patentovaná směs enzymů „BP Clonase“. Směs enzymů katalyzuje rekombinaci a inzerci produktu PCR obsahujícího sekvenci att-B do rekombinačních míst attP ve vektoru Gateway Donor. Jakmile je kazeta součástí cílového plazmidu, v nomenklatuře Gateway se jí říká „Entry clone“ a rekombinační sekvence se označují jako typ Gateway „att L“.

Genovou kazetu v klonu Gateway Entry lze poté jednoduše a efektivně přenést do libovolného cílového vektoru brány (nomenklatura Invitrogen pro jakýkoli plazmid brány, který obsahuje rekombinační sekvence brány „att R“ a prvky, jako jsou promotory a značky epitopu, ale nikoli ORF ) za použití patentované směsi enzymů „LR Clonase“. Byly vyrobeny tisíce plazmidů cílové brány a jsou volně sdíleny mezi vědci z celého světa. Gateway Destinační vektory jsou podobné klasickým expresním vektorům obsahujícím více klonovacích míst před vložením požadovaného genu za použití štěpení restrikčními enzymy a ligace. Gateway Destinační vektory jsou komerčně dostupné od Invitrogen, EMD (Novagen ) a Covalys.

Vzhledem k tomu, že klonování brány používá patentované rekombinační sekvence a patentované směsi enzymů dostupné pouze od společnosti Invitrogen, tato technologie neumožňuje vědcům měnit dodavatele a přispívá k lock-in efekt všech takových patentovaných postupů.

Shrnutí různých kroků při klonování brány:

  • Reakce brány BP: Produkt PCR s ohraničujícími místy att B (v tomto kroku lze také použít jiné metody izolace DNA, jako je restrikční štěpení) + Donorový vektor obsahující místa att P + BP kloáza => Gateway Entry klon obsahující místa att L , lemující požadovaný gen
  • Gateway LR reakce: Vstupní klon obsahující attL místa + Cílový vektor obsahující attR místa a promotory a značky + LR klonáza => Expresní klon obsahující attB místa, lemující požadovaný gen, připravený pro genovou expresi.

Viz také

Reference

  • [1]
  • Hartley JL, Temple GF, Brasch MA (listopad 2000). „Klonování DNA pomocí in vitro místně specifické rekombinace“. Genome Res. 10 (11): 1788–95. doi:10,1101 / gr. 143000. PMC  310948. PMID  11076863.
  • Katzen F (duben 2007). "Gateway (®) recombinational cloning: a biologický operační systém". Expert Opin Drug Discov. 2 (4): 571–89. doi:10.1517/17460441.2.4.571. PMID  23484762.
  • Freuler F, Stettler T, Meyerhofer M, Leder L, Mayr LM (červen 2008). „Vývoj nového vektorového systému založeného na bráně pro efektivní, multiparalelní expresi proteinů v Escherichia coli“. Protein Expr. Purif. 59 (2): 232–41. doi:10.1016 / j.pep.2008.02.003. PMID  18375142.