Stanovení vazby filtru - Filter binding assay
 | Tento článek má několik problémů. Prosím pomozte zlepšit to nebo diskutovat o těchto otázkách na internetu diskusní stránka. (Zjistěte, jak a kdy tyto zprávy ze šablony odebrat) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony)
|
v biochemie nebo chemie, jedním ze způsobů, jak se dozvědět o interakci mezi dvěma molekulami, je určit vazebná konstanta, což je číslo, které popisuje poměr nevázaných a vázaných molekul. Tato informace odhaluje afinitu mezi dvěma molekulami a umožňuje predikci vázaného množství při jakékoli sadě počátečních podmínek.
Aby bylo možné měřit vazebnou konstantu, je třeba najít způsob, jak měřit množství komplexu vytvořeného v rozmezí počátečních koncentrací. Toho lze dosáhnout „značením“ jednoho z druhů fluorescenční látkou, nebo v tomto případě a radioaktivní štítek. DNA je „označena“ přidáním radioaktivního fosfát odvozený od adenosintrifosfát.
A test vazby filtru je jednoduchý způsob, jak rychle studovat mnoho vzorků. Měří to spřízněnosti mezi dvěma molekulami (často proteinem a DNA) pomocí a filtr. Filtr je vyroben z nitrocelulóza papír, který je záporně nabitý. Protože většina proteinů má čistý kladný náboj, je nitrocelulózový papír ideální pro imobilizaci proteinů. DNA je záporně nabitá kvůli fosfátovému páteři a sama se „nelepí“ na nitrocelulózu, nicméně každá DNA, která byla vázána na bílkoviny, se přilepí. Přesné množství DNA „přilepené“ k nitrocelulóze se kvantifikuje měřením množství radioaktivity na filtru pomocí scintilační čítač.
Protein a DNA jsou smíchány v sérii mikrocentrifugačních zkumavek, ve kterých je udržováno konstantní množství DNA, ale množství proteinu je postupně zvyšováno. Tyto vzorky se nechají ekvilibrovat. Po ekvilibraci se stejný objem z každé zkumavky odstříkne na malé, kulaté, nitrocelulózové filtry, které jsou uspořádány na vakuové desce (plochý povrch, na který je zespodu aplikováno vakuum pro nasávání tekutiny dolů). Veškerý protein se bude držet, ale pouze protein, který má vázanou DNA, se zaregistruje v scintilační čítač.
Nyní budete mít číslo, které popisuje množství DNA vázané pro každou použitou koncentraci proteinu, tato informace může být vynesena na vazebnou křivku k určení vazebná konstanta.
Tento test již není široce používán, ale je rychlý a jednoduchý a může poskytnout spoustu informací. Používal by se například pro relativně podrobnou analýzu konkrétní interakce protein-DNA.
Změřte rovnovážnou konstantu:
- Inkubujte označenou DNA s proteinem.
- Nechte dostatek času na to, aby systém dosáhl rovnováhy.
- Směs se filtruje přes filtrační disk vyrobený z nitrocelulózy. Proteiny se vážou na nitrocelulózu, ale DNA ne.
- Veškerá DNA, která je zadržena na filtru, je tam, protože interaguje s proteinem.
- Vysušte filtry a počítejte.
Změřte off-rate:
- Vezměte filtr s navázaným komplexem DNA-protein
- Filtr promyjte pufrem
- Kvantifikujte množství DNA, která zůstala na filtru poté, co byla po určitou dobu promyta.
Další způsob měření off-rate:
- Radioaktivně značená DNA a protein byly preinkubovány společně ve vysokých koncentracích
- V čase 0 byla směs zředěna
- Alikvoty byly testovány v různých časech pomocí nitrocelulózových filtrů