Klonogenní test - Clonogenic assay - Wikipedia

A klonogenní test je technika buněčné biologie pro studium účinnosti specifických látek na přežití a proliferaci buněk. Často se používá v výzkum rakoviny laboratoře k určení vlivu drog nebo záření na množení nádor buňky[1] stejně jako pro titraci částic zabíjejících buňky (CKP) ve virových zásobách.[2] Poprvé byl vyvinut společností T. Puck a Filip I. Marcus na University of Colorado v roce 1955.[3]

Ačkoli tato technika může poskytnout přesné výsledky, stanovení je časově náročné pro nastavení a analýzu a může poskytnout pouze údaje o nádorových buňkách, které mohou růst v kultuře. Slovo „klonogenní“ označuje skutečnost, že tyto buňky jsou klony jeden druhého.

Postup

Experiment zahrnuje tři hlavní kroky:

  1. Ošetření se aplikuje na vzorek buněk.
  2. Buňky jsou "naneseny" na a tkáňová kultura plavidlo a nechá růst.
  3. Vytvořené kolonie jsou zafixovány, obarveny a spočítány.

Na závěr experimentu procento buněk, které přežily léčbu, se měří. Grafické znázornění přežití v závislosti na koncentraci nebo dávce léčiva ionizující radiace se nazývá a křivka přežití buněk.[4]

Pro Testy na zabíjení buněk, přežívající frakce buněk se používá k aproximaci Poissonovy distribuce virových částic mezi buňkami, a proto k určení počtu CKP každou buňkou.

Jakýkoli typ buňka lze použít v experimentu, ale protože cílem těchto experimentů v onkologickém výzkumu je objev účinnější léčby rakoviny, jsou typickou volbou lidské nádorové buňky. Buňky pocházejí buď z připravených „buněčných linií“, které byly dobře studovány a jejichž obecné charakteristiky jsou známy, nebo z a biopsie nádoru u pacienta.[5] Buňky jsou vloženy Petriho misky nebo v destičkách, které obsahují několik kruhových „jamek“. V závislosti na experimentu jsou umístěny určité počty buněk; pro experiment zahrnující ozáření je obvyklé pokládat větší počet buněk se zvyšující se dávkou záření. Například v dávce 0 nebo 1 šedá záření by mohlo být naneseno 500 buněk, ale při 4 nebo 5 šedých by mohlo být naneseno 2500, protože při této úrovni záření je zabito velmi velké množství buněk a účinky specifické léčby by byly nepozorovatelné.

Počítání buněčných kolonií se obvykle provádí pod a mikroskop a je docela únavné. Nedávno byly vyvinuty stroje, které používají algoritmy analyzovat obrázky.[6] Ty jsou buď zachyceny pomocí skener obrázků nebo automatizovaný mikroskop, který může zcela automatizovat proces počítání.[7] Jeden takový automatizovaný stroj funguje tak, že přijímá určité typy desek buněk přes slot (na rozdíl od přehrávače CD), pořizuje fotografie a odesílá je do počítače pro okamžitou analýzu. Spolehlivé počty jsou k dispozici během několika sekund.

Proměnné

Léčba je obvykle a lék, ionizující radiace nebo jejich kombinace.[8] Některé současné výzkumy zkoumají potenciaci účinků drog souběžným ozařováním - a synergický účinek - a v této situaci jsou studovány dvě skupiny: kontrolní skupina, která není léčena tímto lékem; a léčebná skupina, která je léčena tímto lékem. Obě skupiny jsou ozářeny. Pokud se sklon jejich křivek přežití významně liší, pak může být patrný potencující účinek, který lze dále studovat. Vzhledem k tomu, že mnoho nádorových buněk nebude v kultuře růst kolonie, lze jako náhradu použít test buněčné proliferace, který má údajně uspokojivou přesnost při měření synergických účinků mezi ionizujícím zářením a léky. [9]

Důkladná diskuse o slibném výzkumu prováděném pomocí této techniky je nad rámec tohoto textu, ale některé studie zahrnují účinek vyjádření konkrétních geny nebo receptory na buňku, reakce různých typů buněk nebo synergické účinky více léků.

Viz také

Reference

  1. ^ Hoffman, Robert M. (1991). "In vitro testy citlivosti na rakovinu: přehled, analýza a prognóza". Journal of Clinical Laboratory Analysis. 5 (2): 133–43. doi:10.1002 / jcla.1860050211. PMID  2023059.
  2. ^ Ngunjiri, J. M .; Sekellick, M. J .; Marcus, P. I. (2008). „Klonogenní analýza chřipkových virů typu odhaluje neinfekční částice zabíjející buňky (indukující apoptózu)“. Journal of Virology. 82 (6): 2673–80. doi:10.1128 / JVI.02221-07. PMC  2258965. PMID  18184709.
  3. ^ Přepis rozhovoru TWiV @http://www.twiv.tv/TWiV197-082612.pdf
  4. ^ Franken, Nicolaas AP; Rodermond, Hans M; Stap, Jan; Haveman, Jaap; Van Bree, Chris (2006). "Klonogenní test buněk in vitro". Přírodní protokoly. 1 (5): 2315–9. doi:10.1038 / nprot.2006.339. PMID  17406473.
  5. ^ Hamburger, Anne W. (1987). „Klonogenní rozbor lidského nádoru jako modelový systém v buněčné biologii“. International Journal of Cell Cloning. 5 (2): 89–107. doi:10,1002 / stopka. 5530050202.
  6. ^ Niyazi, Maximilián; Niyazi, Ismat; Belka, Claus (2007). „Počítání kolonií klonogenních testů pomocí denzitometrického softwaru“. Radiační onkologie. 2: 4. doi:10.1186 / 1748-717X-2-4. PMC  1770926. PMID  17212832.
  7. ^ Dahle, Jostein; Kakar, Manish; Steen, Harald B .; Kaalhus, Olav (2004). "Automatické počítání kolonií savčích buněk pomocí plochého skeneru a zpracování obrazu". Cytometrie. 60A (2): 182–8. doi:10.1002 / cyto.a.20038.
  8. ^ Carney, DN; Winkler, CF (1985). "In vitro testy chemoterapeutické citlivosti". Důležitý pokrok v onkologii: 78–103. PMID  3916747.
  9. ^ Liu, Q; Meng, W (2015). „Přizpůsobení platformy pro screening léčiv k objevení asociací molekulárně zaměřených radiosenzitizérů s genomickými biomarkery“. Výzkum molekulární rakoviny. 13: 713–720. doi:10.1158 / 1541-7786.MCR-14-0570. PMC  4410013. PMID  25667133.