Buněčná kultura rozhraní vzduch-kapalina - Air-liquid interface cell culture

Pseudostratifikovaný epitel buněčné kultury průdušnice ALI si klade za cíl znovu vytvořit in vitro

Buněčná kultura rozhraní vzduch-kapalina (ALI) je metoda buněčná kultura kterým jsou bazální kmenové buňky pěstovány s bazálními povrchy v kontaktu s médiem a horní část buněčné vrstvy je vystavena vzduchu. Buňky se poté zvednou a médium se mění, dokud se nevyvine mukociliární fenotyp a pseudostratifikovaný epitel, podobně jako tracheální epitel.[1][2]

Tato metoda buněčné kultury si klade za cíl použít ke studiu základních aspektů respiračního epitelu, jako je např buněčná signalizace, modelování nemocí a regenerace dýchání.[1][2]

Buněčná kultura rozhraní vzduch-kapalina se srovnává se standardními postupy buněčné kultury tím, že se konkrétně zaměřuje na obnovení pseudostratifikovaného pruhování dýchacích cest in vitroa zaměřené na udržení výklenku dýchacích cest (shora dolů) 1) vzduchu, 2) pseudostratifikovaného epitelu a 3) kapalného média. Standardní procesy buněčné kultury nejsou specifické pro dýchací cesty, nebo se točí kolem orgánového systému, který vyžaduje jiné prostředky údržby buněk in vitro.

Protokol

Protokol pro kulturu rozhraní vzduch-kapalina se opírá o dva klíčové kroky: izolaci epiteliálních buněk z organismu a kultivaci těchto buněk

Izolace

Orgány s epiteliálními buňkami jsou izolovány[1] (rozřezané) a umístěny do PBS k vyčištění veškerých nečistot a tyto izolované orgány jsou štěpeny za použití trypsin. Po natrávení inhibitor ROCK (Kináza spojená s Rho inhibitor) je přidán, aby se zabránilo buněčné apoptóze izolovaných buněk. Zbývá strávený buněčný obsah smíchaný s tkání; pronase /DNAse se přidává k čištění mrtvého buněčného materiálu i veškerého zbývajícího proteinového materiálu. Výsledný materiál je jemně nasekán v médiu a jednotlivé izolované vzorky buněk jsou umístěny do příslušně označených mikrocentrifuga zkumavky a třepe se při 37 ° C po dobu 30 - 40 minut. Jakmile byly buňky inkubovány, jsou naneseny na membrány transwell pro růst.

Kultura

Destičkové buňky s SABM (Small Airway Basal Media) k obohacení buněk o živiny za účelem růstu a případného diferenciace.[1] Jakmile jsou buňky naočkovány, jsou pěstovány 3–7 dní za pečlivého pozorování (při změně média každý den), dokud není dosaženo požadovaného soutoku.

Více nedávno, studie o In vitro generace pneumocytů typu II zahájená z lidských kmenových buněk CD34 (+) byla přesně prokázána metodou buněčné kultivace mezi vzduchem a kapalinou.[3]

Využití ve vědeckých studiích

Kultury rozhraní vzduch-kapalina se používají v mnoha kmenová buňka studie, jejichž cílem je znovu vytvořit pseudostratifikovaný epitel in vitro. Tyto studie mohou přispět k novým poznatkům v různých tématech:

Rakovina

V modelování rakovina a různá další onemocnění, byly kmenové buňky v bazální vrstvě tracheálního epitelu (bazální kmenové buňky) izolovány a použity při vývoji 3D organoidy které by mohly být použity pro různé studie, včetně nádor studie. Použitá metoda buněčné kultury zahrnuje izolaci buněk do kultivace s růstovými faktory, které rostou v průběhu času. Jakmile byly buňky vypěstovány, byly smíchány Matrigel a kultivovány tak, aby vytvářely 3D organoidy.[4][5]

Růst / diferenciace buněk

Při modelování pseudostratifikovaného epitelu in vitro, bylo provedeno více buněčných studií za účelem stanovení povahy buněk - jejich diferenciačních drah, jejich růstového mechanismu, jejich mechanismu opravy / reakce ve stavu po poranění. Jedna nedávná studie ukázala, že diferencované buňky v respiračním epitelu (sekreční buňky a řasinkové buňky primárně) se mohou dediferencovat do svého naivního stavu a znovu se stát kmenovými.[1][5]

Upravený protokol: udržování kmenových vlastností v bazálních kmenových buňkách

Jako adaptace na protokol kultivace rozhraní vzduch-kapalina byly vyvinuty pomocné protokoly používající rámec ALI k udržení naivních vlastností kmenových buněk po dlouhou dobu.[6]

Reference

  1. ^ A b C d E Tata, Purushothama Rao; Mou, Hongmei; Pardo-Saganta, Ana; Zhao, Rui; Prabhu, Mythili; Law, Brandon M .; Vinarsky, Vladimir; Cho, Josalyn L .; Breton, Sylvie (listopad 2013). "Dediferenciace aktivovaných epiteliálních buněk na kmenové buňky in vivo". Příroda. 503 (7475): 218–223. doi:10.1038 / příroda12777. ISSN  1476-4687. PMC  4035230. PMID  24196716.
  2. ^ A b „Kultura rozhraní vzduch-kapalina pro výzkum dýchání“. www.stemcell.com. Citováno 2018-03-30.
  3. ^ Srikanth, Lokanathan; Venkatesh, Katari; Sunitha, Manne Mudhu; Kumar, Pasupuleti Santhosh; Chandrasekhar, Chodimella; Vengamma, Bhuma; Sarma, Potukuchi Venkata Gurunadha Krishna (únor 2016). „Generování pneumocytů typu II in vitro může být zahájeno v lidských kmenových buňkách CD34 (+).“ Biotechnologické dopisy. 38 (2): 237–242. doi:10.1007 / s10529-015-1974-2. ISSN  1573-6776. PMID  26475269.
  4. ^ Rock, Jason R .; Onaitis, Mark W .; Rawlins, Emma L .; Lu, Yun; Clark, Cheryl P .; Xue, Yan; Randell, Scott H .; Hogan, Brigid L. M. (4. 8. 2009). „Bazální buňky jako kmenové buňky myší průdušnice a epitelu dýchacích cest člověka“. Sborník Národní akademie věd. 106 (31): 12771–12775. doi:10.1073 / pnas.0906850106. ISSN  0027-8424. PMC  2714281. PMID  19625615.
  5. ^ A b Tata, Purushothama Rao; Rajagopal, Jayaraj (01.03.2017). „Plasticita v plicích: tvorba a rozbití buněčné identity“. Rozvoj. 144 (5): 755–766. doi:10.1242 / dev.143784. ISSN  0950-1991. PMC  5374348. PMID  28246210.
  6. ^ Mou, Hongmei; Vinarsky, Vladimir; Tata, Purushothama Rao; Brazauskas, Karissa; Choi, brzy H .; Crooke, Adrianne K .; Zhang, Bing; Solomon, George M .; Turner, Brett (2016). „Duální inhibice signalizace SMAD umožňuje dlouhodobé rozšiřování různých bazálních buněk epitelu“. Buňková kmenová buňka. 19 (2): 217–231. doi:10.1016 / j.stem.2016.05.012. PMC  4975684. PMID  27320041.